人增生瘢痕成纤维细胞_RNA干扰CyclinD1表达对增生性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡调控的研究.docx

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1、人增生瘢痕成纤维细胞_RNA干扰CyclinD1表达对增生性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡调控的研究 摘 要 增生性瘢痕(HS)是创伤后组织过度修复的表现,经常造成局部畸形或伴有不同程度的功能障碍,其形成机制目前尚未完全明白。成纤维细胞异样增殖导致瘢痕过度增生和持续存在,与细胞周期蛋白D1(CyclinD1)关系亲密,因此应用RNA干扰技术抑制增生性瘢痕成纤维细胞CyclinD1基因表达,并观测干扰后产生的效果,为RNA干扰技术在病理性瘢痕的基因治疗方面的应用供应依据。 关键词 细胞周期蛋白D1 增生性瘢痕 细胞增殖 doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.24.004

2、试剂与方法 试剂:胰蛋白酶、小牛血清、DMEM培育基,MTT:3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenyt-etrazoliumromide,3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑,Bio-Rad 550型酶标仪,HifectinI真核细胞转染试剂,FITC-Annexin/PI细胞凋亡检测试剂盒。小干扰RNA设计与合成:用ambion在线软件siRNAtargetfinder设计siRNA-CyclinD1分子,其正义链为5-CAAACAGAUCAUCCGCAAAtt,反义链为5-UUUGCGGAUGAUCUGUUUGtt。s

3、iRNA-CyclinD1分子干扰CyclinD1基因的第664684位核苷酸,靶序列为AACAAACAGATCATCCGCAAA。采纳化学法分别合成siRNA-CyclinD1分子的正义链和反义链,经过变性退火处理后得到双链siRNA-CyclinD1分子,用DEPC处理的双蒸水配成50mol/L的储存液,-70冻存备用。 方法:增生性瘢痕成纤维细胞培育:标本均取自我院增生性瘢痕手术患者,经临床及病理诊断证明。细胞培育于含10%小牛血清的DMEM培育基中(含100g/ml链霉素和100U/ml青霉素),37、5% CO2 细胞培育箱培育传代。siRNA-CyclinD1转染细胞:转染前24小

4、时,用0.25%胰酶消化液消化并收集细胞(第6代),以2105细胞/孔的密度接种于24孔板,加入500l不含抗生素的DMEM培育基,5%CO2、37恒温培育20小时,细胞融合度约85%。将200lsiRNA-D-Lipofectamine2000复合物干脆加入含细胞和培育基的24孔板中,轻轻摇动混匀,5%CO2、37恒温培育,10小时后吸弃转染液,加入含10%小牛血清DMEM培育基,接着培育,并分别于24、48、72小时收集细胞进行观测。同时设立2个比照组,空载体组(成纤维细胞用等量脂质体处理)、未转染比照组(不转染siRNA也不转染空脂质体)作为比照。双标记流式细胞术分析细胞凋亡用0.25%

5、的胰酶消化siRNA-CyclinD1处理后的细胞,离心收集细胞106个,PBS洗2次,每次5分钟。加入400l BindingBuffer,混匀后加入10l FITC-AnnexinV,再加入5l PI,室温避光反应30分钟。1小时内进行流式细胞术检测,以不加FITC-AnnexinV-及PI的细胞作阴性比照。每个样品采集104个细胞数据,经Cellquest软件分析4个区域(L,UR,LL,LR)内的细胞百分数。UR和LR区域的细胞百分数代表了凋亡细胞百分比。MTT法检测成纤维细胞增殖:siRNA转染成纤维细胞24、48、72小时后,每孔加入MTT(5mg/ml)100l,37、5%CO2孵箱中接着孵育4小时,弃上清,加入二甲基亚砜100l,震荡5分钟,在波长570nm处读取吸光度(A)值。 设立2个比照组:一组转染非特异siRNA,另一组转染空脂质体。每个时间点实施平行3孔检测,取3孔平均值做为该时间点的A570值。计算各个时间点细胞增殖抑制率,计算公式为:细胞增殖抑制率=(1-转染siRNA-CyclinD1后的A570值/未处理组细胞的A570值)100%。