水产品中氯霉素快速检测,胶体金免疫层析法（KJ202005）.docx

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1、水产品中氯霉素快速检测,胶体金免疫层析法（KJ202005）附件5 水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法 （KJ201905） 1 范围 本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。 2 原理 本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的改变。通过检测线与限制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。 3 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为

2、GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 正己烷。 3.1.2 丙酮。 3.1.3 乙酸乙酯。 3.1.4乙腈 3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO42H2O。 3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO412H2O。 3.1.7 氯化钠 3.1.8 复溶液：称取0.12 g磷酸二氢钠 (3.1.5)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16 g (3.1.6)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A 2.8 mL、溶液B 7.2 mL、氯化钠(3.1.7)0.85 g，用水溶解并稀释至100 mL，得磷酸盐缓冲液，

3、即为复溶液。 3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。 3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。 3.2 标准物质 氯霉素标准物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度98.6%。 表1 氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量 氯霉素 Chloramphenicol 56-75-7 C11H12Cl2N2O5 323.13 注：或等同可溯源物质。 3.3标准溶液配制 3.3

4、.1 氯霉素标准储备液（1 mg/mL）：精密称取氯霉素标准物质（3.2）10 mg，置于10 mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL的氯霉素标准储备液。4避光保存，有效期6个月。 3.3.2 氯霉素标准中间液A（10 g/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1 mg/mL）（3.3.1）0.1 mL，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成 10 g/mL的氯霉素标准中间液A。4避光保存，有效期3个月。 3.3.3 氯霉素标准工作液（0.01 g/mL）：精密移取氯霉素标准中间液A（10 g/mL）（3.3.2）0.01

5、mL分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01 g/mL的氯霉素标准工作液。临用新配。 3.4材料 3.4.1固相萃取小柱：Cleanert Silica，200 mg/6mL。LOT：0170198。 3.4.2免疫胶体金试剂盒（在230、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内运用）。 3.4.2.1 金标微孔。 3.4.2.2 试纸条或检测卡。 4 仪器和设备 4.1 移液器：200 L、1 mL和5 mL。 4.2 涡旋混合器。 4.3 离心机：转速4000 r/min。 4.4 电子天平：感量分别为 0.01 mg和 0.01 g。 4.5 样品浓缩仪：如有须要

6、。 4.6 环境条件： 温度：1525，相对湿度：60%。 5分析步骤 5.1试样制备 取具有代表性样品约500 g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入干净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。 5.2试样提取和净化 精确称取试样6 g（精确至0.01 g）置于50 mL具塞离心管中，依次加入1 mL水和8 mL乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5 min，以4000 r/min离心5 min。转移全部乙酸乙酯层于50 mL具塞离心管中，加入正己烷25 mL，氯化钠1 g涡旋混匀，4000 r/min 离心1 min，上清液待净化。5 mL丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si

7、硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5 mL丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于40氮气吹干，精密加入600 L复溶液（3.1.8），涡旋混合1 min，作为待测液。 5.3 测定步骤 5.3.1 检测卡与金标微孔测定步骤 吸取150 L样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 510次使混合匀称，室温温育3 min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育58 min，对结果进行判定。 5.3.2 试纸条与金标微孔测定步骤 吸取150 L样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5

8、10次使混合匀称，室温温育3 min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育3 min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于5 min内进行结果判定。 5.3.3 检测卡测定步骤 吸取150 L样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育58 min，对结果进行判定。 5.4质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1 空白试验 称取空白试样，根据5.2和5.3步骤与样品同法操作。 5.4.2 加标质控试验 精确称取空白样品6 g或适量（精确至0.01 g）置于15 mL具塞离心管中，加入180

9、L氯霉素标准工作液（0.01 g/mL）（3.3.3），使氯霉素浓度为0.3 g/kg，一式2份，根据 5.2和5.3步骤与样品同法操作。 6 结果判定要求 通过对比限制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的改变，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。 6.1 无效 限制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 6.2 阳性结果 检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比限制线（C线）颜色浅，表明样品中氯霉素含量高于方法检测限，判定为阳性。 6.3 阴性结果 检测线（T线）颜色比限制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与限制线（C线

10、）颜色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性。 6.4质量限制要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。 7 结论 如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采纳确证方法进行确证检测。 8 性能指标 8.1 检测限 氯霉素为0.1 g/kg。 8.2 灵敏度 灵敏度应98%。 8.3 特异性 特异性应90%。 8.4 假阴性率 假阴性率应1%。 8.5 假阳性率 假阳性率应10%。 注：性能指标计算方法见附录A 9其他 本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法运用者供应便利，在运用本方法时不做限定。方法运用者在运用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察

11、，应满意本方法规定的各项性能指标。 本方法参比标准为GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定 (包括全部修改单)。 附录 A 定性方法性能计算表 样品状况a 检验结果b 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性 N21 N22 N2.=N21+N22 总数 N.1=N11+N21 N.2=N12+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 显著性差异(2) 2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1 灵敏度（p+） p+=N11/N1. 特异性（p-） p-=N22/N2. 假阴性率(pf-) pf-=N12/N1.=1-灵敏度 假阳性率(pf+) pf+=N21/N2.=1-特异性 相对精确度 （N11+N22）/(N1.+N2.) 注：N:任何特定单元的结果数，第一个下标指行，其次个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示全部的第一行，N.2表示全部的其次列；N12表示第一行，其次列。 a由基准方法检验得到的结果； b由本方法检验得到的结果。灵敏度的计算运用确认后的结果。 本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。 验证单位：陕西省食品药品检验所、广东省药品检验所、四川省食品药品检验检测院。 主要起草人：李倩、阎安婷、陈煜、杨国伟。