经静脉神经干细胞移植治疗难治性癫痫的实验研究 干细胞移植有风险吗.docx

《经静脉神经干细胞移植治疗难治性癫痫的实验研究 干细胞移植有风险吗.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《经静脉神经干细胞移植治疗难治性癫痫的实验研究 干细胞移植有风险吗.docx（8页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、经静脉神经干细胞移植治疗难治性癫痫的实验研究 干细胞移植有风险吗 132100吉林省吉林市中心医院神经内科 摘 要 目的：视察难治性癫痫模型静脉注射骨髓基质细胞后行为学及细胞形态学的变更，犯难治性癫痫的临床治疗开拓新的途径，奠定理论基础。方法：将20只SD大鼠随机分模型组（A组）、移植组（B组），每组10只。在大脑立体定向仪上定位大鼠大脑海马CA3区，用微量进样器缓慢注入KA 1l，制成难治性癫痫模型，然后B组经尾静脉注入Hoeschst33342标记的骨髓基质细胞1ml。取A组、B组鼠脑做HE切片，视察细胞形态学改变。结果：模型组的病理变更表现为海马四周卫星灶形成，腔隙层、辐状层和锥体细胞层

2、有神经元吞噬现象，神经元缺失，其中CA3区表现得最为明显，齿状回苔醉状纤维出芽进行性增加。移植组较模型组海马四周卫星灶变小，细胞间隙较移植前减小，细胞增多且排列较整齐。结论：骨髓基质细胞具有修复癫痫病灶的实力。 关键词 癫痫 骨髓基质细胞 诱导分化 移植 doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2011.11.005 难治性癫痫是指临床经过迁延，常见的癫痫发作至少每个月4次以上，应用适当的第一线抗癫痫药物正规治疗，药物的血中浓度在有效范围内，无严峻的药物不良反应，至少视察2年仍不能限制发作，影响日常生活，同时并无进行性中枢神经系统疾病或占位性病变者。目前常用的抗癫痫药物在神经

3、系统、消化系统、心血管方面的不良反应影响了其临床应用。外科手术切除癫痫病灶的方法会对病人的远期生活质量产生很大的影响。80年头很多学者致力于从胚胎脑中分别出神经细胞移植入受损的脑内，使神经功能得到明显改善，这说明神经细胞移植是治疗神经疾病的有效手段1，2。探讨发觉，骨髓中间质干细胞（MSCs）具有干细胞持续增殖和多向分化的特性，在肯定的条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等3，可自体移植，不存在免疫排斥反应，使其成为细胞移植治疗志向的选择。 采纳46周龄，体重120160g的SD大鼠为探讨对象，将以Hoeschst33342标记的BMSCs经尾静脉注入难治性癫痫的大鼠体内，了

4、解细胞移植治疗对癫痫大鼠神经功能的改善状况，从而探讨BMSCs对癫痫的修复和治疗作用，现报告如下。 资料与方法 试验动物：细胞培育选择46周龄Wister大鼠，动物模型选择68周龄Wister大鼠。 主要试剂：DMEM-LG培育基、胎牛血清、胰蛋白酶、bFGF、EGF、Hoeschst33342、Percoll淋巴细胞分别液、戊巴比妥、海人酸、肝素、注射用青霉素钠、注射用链霉素。 主要仪器：细胞培育瓶、超净工作台、CO2培育箱、倒置相差显微镜（Olympus）、离心机、电子天平、冰箱、烤箱、微量进样器、脑立体定向仪。 试剂配制：低糖DMEM培育基的配制：DMEM培育基10.0g，青霉素105I

5、U，链霉素105IU，NaHCO33.7g，加入三蒸水800ml，用稀盐酸调制pH值7.2，定溶1000ml，0.22m微孔滤膜过滤。将配置的培育液进行负压抽滤除菌，分装备用。运用前加胎牛血清（终浓度10%）。PBS液的配制：NaCl 8g，KCI 0.2g，Na2HPO4 1.15g，KH2PO4 0.2g，加三蒸水800ml，充分溶解后，调pH值7.2，定溶至1000ml。胰蛋白酶的配制：称取0.25g胰蛋白酶，将其溶于100ml PBS液中，干净工作台中抽滤分装备用。 试验方法：大鼠骨髓基质细胞体外分别、培育：取46周龄Wister大鼠，1%戊巴比妥0.4ml/100g腹腔麻醉后拉颈处死

6、，置于75%酒精中浸泡510分钟，再用75%酒精、3%碘酒消毒大鼠双侧下肢，在无菌条件下取大鼠双侧股骨和胫骨，剔除骨表面附着的肌肉组织，用无菌注射器抽取DMEM培育液，不含胎牛血清。从骨的一端冲洗骨髓腔，反复冲洗数次，另一端收集冲洗出来的骨髓，将收获的骨髓用5号针头注射器反复抽吸以打散组织块成为匀称的细胞悬液，然后以1:1的比例缓慢叠加到密度1.073g/L的percoll淋巴细胞分别液上，以2000转/分别心15分钟；收集中间乳白色的单个核细胞层，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培育液调整细胞密度2105/ml，然后将单个核细胞接种到25cm2的塑料培育瓶中，置于37、5%CO2饱和湿度的C

7、O2培育箱中培育，24小时后在倒置显微镜下视察细胞的贴壁状况，细胞贴壁生长轻摇瓶身不易脱落后，在倒置显微镜下可见不贴壁生长的红细胞。72小时后在无菌干净工作台中首次全量换液，以后每23天全量换液1次。原代细胞培育约10天左右长满培育瓶的80%，呈成纤维细胞样生长，此时即可用0.25%胰蛋白酶消化原代细胞，在倒置显微镜下见贴壁细胞基本挛缩成类圆形，然后加入含胎牛血清的DMEM培育液终止消化，并将细胞液吹打匀称，接种于2个细胞培育瓶中进行1:2传代扩增培育。选取生长良好的第2代细胞，调解细胞密度为105/ml接种到24孔培育板，用滴管滴加bFGF（10g/ml）及EGF（10g/ml）各1滴/孔，

8、放入CO2培育箱中培育，以后每34天全量换液1次。4周后大量丝状纤维突起向神经元细胞和胶质细胞分裂扩增。神经干细胞的收集和标记：选取生长良好的神经干细胞，用0.25%胰蛋白酶室温消化约3分钟，用含胎牛血清的培育液终止消化，PBS清洗，1000转/分别心，离心5分钟，收集细胞，将培育液Hoeschst33342加入大鼠BMSCs培育液中，终浓度50g/ml，于37培育箱中避光共同培育24小时。然后PBS洗涤3次，去处未结合Hoeschst33342，收集细胞，用不含胎牛血清的LG-DMEM培育液将细胞制成细胞悬液，密度2105/ml。放入冰块中备用（放置时间 统计学处理：各组数据用（XS）表示，

9、用SPSS10.0软件进行数据分析，P0.05差异有显著性，P0.01差异有特别显著性。结果 癫痫大鼠MSCs移植后HE染色：通过对A、B组大鼠脑组织HE染色片子进行比较发觉，A组的病理表现为海马四周卫星灶形成（由于神经元受损造成的胶质细胞在神经元四周积累），腔隙层、辐状层和锥体细胞层有神经元吞噬现象，神经元缺失，其中CA3区表现得最为明显, 该区神经元与正常锥体细胞相比，细胞体积明显变小，细胞排列不整齐、稀疏，细胞间隙增大，胞体不规则，细胞突起明显削减，胞核固缩，核仁不明显，损伤严峻者细胞轮廓不明显,齿状回苔癣状纤维出芽进行性增加。移植组的海马卫星灶减小，细胞间隙较A组减小，细胞增多且排列较

10、整齐。 讨 论 在试验中，BMSCs主要是通过尾静脉移植的方式，将预先用Hoeschst33342标记的BMSCs移植入癫痫大鼠体内，该方法的优点是对脑组织不造成2次损伤，移植物的数量不受限制，便于提高移植物达到缺血区域的数量5。BMSCs被移植入鼠脑后能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。有探讨报道，在Parkinsons disease（PD）模型的小鼠或大鼠纹状体内植入BMSCs后可视察到BMSCs在脑内存活较长时间，随着时间的延长，迁移范围扩大，并在脑内表达神经丝蛋白（NF-M）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）和酪氨酸经化酶（TH）样免疫活性，PD

11、大鼠或小鼠的异样行为也有所缓解6,7。探讨者在如何提高BMSCs分化为神经元的比例等方面进行了探究, 本试验采纳bFGF、EGF作为增殖因子，胜利地使BMSCs在体外得以扩增，胜利地使BMSCs在体外转化为NSC和成熟的神经细胞，从而提高了BMSCs分化为神经元的比例。 BMSCs作为滋养层能诱导ESC大量分化为神经元。Kawasaki等8探讨发觉，从颅骨BMSCs来的PA6细胞在与小鼠ESC共培育时，90%的ESC分化为NSC，其中52%可分化为神经元。此外，BMSCs还能干脆诱导NSC分化为神经元。娄淑杰等9采纳细胞共培育和免疫组织化学染色方法，发觉体外培育的中脑NSC在与成年大鼠BMSC

12、s共培育7天后，NSC后代中神经元的比例明显高于自然分化组，提示BMSCs供应的微环境可明显促进NSC分化为神经元。BMSCs提高NSC后代中神经元的比例是由于它不仅能促进NSC的分化，而且还能增加分化后神经元的存活率，这是BMSCs分泌可溶性因子作用于NSC所致，细胞表面分子并没有参加BMSC对NSC的分化作用10。 综上所述，BMSCs用于移植治疗难治性癫痫是可行的，也是有效的。 参考文献 1 王焕明,徐如祥,姜晓丹,等.大鼠骨髓源性神经干细胞移植治疗颞叶癫痫试验探讨.中风与神经疾病杂志,2007,2. 2 Labber R,Firl A,Mufson EJ,et al.F etal br

13、ain transplantsireduction of congnitive deficits in rats with frontal cortex lesionsJ.Science,1983,221:470-472. 3 Muraglia A,Cancedda R,Quarto R.Clonal me senchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical modeJ.J Cell Sci,2000,113（7）:1161-1166. 4 Mahmood

14、 AD,Dunyue LU,Yi L,et al.Intra cranial bone marrow Transplantation after traumatic brain injury improving functional out come in adult ratsJ.J Neurosurg,2001,94（4）:589-595. 5 Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cellsJ.Science,1999,284（5411）:143

15、-147. 6 Javazon EH,Colter DC,Emily J,et al.Rat marrow stomal cells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-drived colonies than human marrow stromal cells.stem cellsJ.2001,19（3）:219-225. 7 Sekiya I,Larson BL,Smith JR,et al.Expansion of human adult stem cells fr

16、om bone marrow stroma:conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality.stem cells,from bone marrow stroma:conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their qualityJ.Stem Cells,2002,20:530-541. 8 Prockop DJ,Sekiya I,Colter DC.Isolation and

17、charactenzation of rapidly self-renewing stem cells from cultures of human bone marrow stromxl cellsJ.Cytotherapy,2001,3:393-396. 9 娄淑杰,顾平,李怡.等.骨髓基质细胞对神经干细胞分化为神经元的影响.中国神经科学杂志,2002,18:490-494. 10 Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cellsJ.Science,1999,284（5411）:143-147.