珍珠母水解液中总氮的含量测定及其HPLC的指纹图谱建立-水解池出水总氮比原水高.docx

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1、珍珠母水解液中总氮的含量测定及其HPLC的指纹图谱建立|水解池出水总氮比原水高 R284 A1672-3873（2011）03-0044-03 目的 从定量与定性，局部与整体方面建立珍宝母的质量限制方法。方法 将珍宝母用硫酸水解后，采纳氮测定法和HPLC对10批珍宝母水解液进行总氮和指纹图谱测定。结果 总氮测定中，精密度试验RSD为1.18%，重现性试验RSD为1.72%，方法稳定性RSD为1.62%，珍宝母水解液中总氮含量较低，均值为0.16 mg/ml，RSD为13.9%，各批间总氮含量有肯定差异，HPLC指纹图谱测定通过了方法学考察，建立了标准指纹图谱，10批样品相像度较好。结论 通过总

2、氮和指纹图谱限制，可使珍宝母质量在定量与定性，局部与整体方面得到良好的限制，同时为其它中药材的质量限制供应了思路。 珍宝母水解液；总氮；指纹图谱 The determination of the total nitrogen and the establishment of HPLC fingerprint chromatogram in concha margaritifera hydrolysate SUN Sheng-bin*, CHEN Xiang-yu, LI Jia (Shineway Pharmaceutical Co., Ltd., Shijiazhuang Hebei 051

3、430, China) Abstract: Objective To establish the quality control method for Concha margaritifera quantitively and qualitatively, but also partially and wholly. Methods Hydrolyze 10 batches of Concha margaritifera with sulfuric acid, then apply Kjeldahl and HPLC methods to determine the total nitroge

4、n and fingerprint separately. Results In determination of the total nitrogen, RSD is 1.18% in the test of precision, RSD is 1.72% in the test of reiteration, RSD is 1.62% in the test of stabilization, The content of total nitrogen in the concha margaritifera hydrolysate is low and therere also diffe

5、rences among batches, average is 0.16mg/ml, RSD is 13.9%. The methodology of fingerprint determination is acceptable and thus the standard fingerpint is established. The similarities of 10 batches are good. Conclusion According to the test of total nitrogen and fingreprint, we may control the qualit

6、y of Concha margaritifera quantitively and qualitatively, partially and wholly. And it also provides a model for controls of other Chinese medicinal materials. Key words: Concha margaritifera hydrolysate; total nitrogen; Fingerprint chromatogram 珍宝母在药典中收载为三角帆蚌、褶纹冠蚌或马氏珍宝贝的贝壳。含90%以上的碳酸钙、角蛋白和其他一些微量元素1，

7、近年，有关珍宝母中成分探讨和水解提取工艺探讨时有报道2,3，本探讨采纳不同产地的三角帆蚌经硫酸水解，然后进行总氮测定和HPLC指纹图谱建立，不仅为珍宝母在质量限制方面供应了思路，而且为中药质量限制供应了一种整体定性的方法模式。 1 原料与仪器 1.1 原料 珍宝母（浙江诸暨4批、广西2批、江苏1批、广东2批、山东1批），药材由河北省药品检验所孙宝惠老师鉴定。 硫酸（保定风帆化工厂）；40%氢氧化钠溶液（天津市化学试剂一厂）、2%硼酸溶液（天津市化学试剂三厂）、硫酸滴定液（0.005 mol/L）、30%硫酸铜溶液（天津市迪博化工有限公司），甲基红-溴甲酚绿混合指示液（甲基红为崇明县裕安人民公社

8、十六大队综合厂，溴甲酚绿为天津市申泰化学试剂有限公司）、无水硫酸钠（天津市光复科技发展有限公司）、甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）均为分析纯。乙腈（RCI Labscan，色谱纯）。 1.2 仪器 凯氏定氮仪、凯氏烧瓶；waters2695高效液相色谱仪 2 样品制备 2.1 珍宝母水解液的制备 称取珍宝母粉5.0 g，置耐酸容器中，加入6倍量3 mol/L的H2SO4溶液后，待气泡消逝，再加热至98100 ，保温水解8小时，至珍宝母粉由灰色转为黄白色沉淀，停止加热，降温至4050，过滤，滤渣用少量热水洗涤3次，洗液与滤液合并，放冷后又有白色针状结晶析出，再过滤除去，得淡黄色透亮溶液，定容

9、至50 ml备用。 2.2 供试溶液的制备 取珍宝母水解液稀释2倍后用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。 3 方法与结果 3.1 总氮测定 照氮测定法(中国药典2005年版一部附录 L其次法)测定。 3.1.1 精密度试验 精密量取同一批号珍宝母水解液10.0 ml，照氮测定法测定6次，6次的结果分别为0.183、0.178、0.182、0.180、0.183、0.179 mg/ml，RSD为1.18%，表明本法精密度良好。 3.1.2 重复性试验 取同一批号珍宝母粉6份，每份约5.0g，精密称定，分别按2.1、2.2项下方法制供试溶液，依次测定总氮，6次的结果分别为0.177、0.179、0.1

10、83、0.182、0.175、0.181 mg/ml，RSD为1.72%，表明本法重现性良好。 3.1.3 供试溶液稳定性 精密称取同一批号珍宝母粉5份，每份约5.0g，分别按2.1、2.2项下方法制供试溶液，分别在0、4、8、16、24h时测定总氮，不同时间点总氮含量的平均值为0.181、0.180、0.176、0.179、0.184 mg/ml，RSD为1.62%，表明本法重现性良好。表明本法稳定性良好。 3.1.4 样品测定 批号1、2、3、4产地为浙江诸暨；5、6为广西；7为江苏；8、9为广东；10为山东，分别按2.1、2.2项下方法制备供试溶液，结果见表1 3.2 指纹图谱测定 3.

11、2.1 色谱条件 流淌相为乙腈和0.1%甲酸水溶液的混合溶液，A相为乙腈，B相为0.1甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.5 ml/min，色谱柱：Phenomenex Luna 反相 C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 µm）；检测波长为254 nm；柱温25。 梯度洗脱程序如下表： 取样品溶液1（浙江诸暨）10 µl进样，连续进样5次，检测指纹图谱，以保留时间为16.6 min的峰（S峰）为标准峰各共有峰的相对保留时间RSD小于3.0%，相对峰面积的RSD小于3.0%，以第一张图为参照谱，进行自动匹配，各指纹图谱的相像度大于0.95，精密度良好，符合指纹图谱探讨

12、技术要求。 3.2.2.2 重复性 取同批次珍宝母，平行5份，依2.2项下方法制备供试品溶液，检测指纹图谱。以保留时间为16.7 min的峰（S峰）为标准峰各共有峰的相对保留时间RSD为小于3.0%，相对峰面积的RSD小于3.0%，以第一张图为参照谱，进行自动匹配，各指纹图谱的相像度大于0.95，重复性良好，符合指纹图谱探讨技术要求。 3.2.2.3 稳定性 取样品溶液1（浙江诸暨），分别在0，24，48，72h进样，检测指纹图谱，以保留时间为16.6 min的峰（S峰）为标准峰各共有峰的相对保留时间RSD为3.0%，相对峰面积的RSD为3.0%，以第一张图为参照谱，进行自动匹配，各指纹图谱的

13、相像度大于0.95，结果表明样品在72h内稳定。 3.2.3 标准图谱的生成与相像度计算 精密称取样品，依法制备样品，按3.2.1项下的色谱条件进样，记录色谱图，依据10批次样品指纹图谱的特点，以4个主要色谱峰作为标记进行多点校正（见图1 各珍宝母水解液指纹图谱），采纳中药色谱指纹图谱相像度评价系统A版采纳平均数法生成比照图谱（见图2 珍宝母水解液标准图谱）。 积分参数：斜率灵敏度10；峰宽0.05；最小峰面积2；最小峰高1 积分区间：0-65 min 4 探讨 4.1 原材料的选择与质量稳定性对工业化大生产的产品质量会产生重大影响，因此原材料的来源与产地固定是保证质量稳定的基础。本文仅选择药

14、典收载的不同产地的三角帆蚌进行总氮与指纹图谱初步探讨，以考察相同种属不同产地的珍宝母的质量状况。 4.2 珍宝母总氮测定RSD偏大，从测定结果看，造成各样品含量改变不仅是产地不同引起，而且同一产地的不同批次也是影响因素，两者对总体的影响相当。所以，造成这种差异可能是由于生长环境、生活状态不同，有待进一步探讨。珍宝母水解液总体含氮平均值为0.16 mg/ml，但用于药材质量稳定性的限制，仍有肯定的参考价值。 4.3 珍宝母指纹图谱通过了精密度、稳定性、重复性方法考察，符合指纹图谱探讨技术要求，方法学考察时，由于珍宝母指纹峰较少属氨基酸类，因此选择峰面积最大的色谱峰为参照峰。稳定性试验进行72小时

15、长时间考察，目的是结合工业生产较长时间放置其水解液中的氨基酸在相应的储存环境下的稳定性。10批珍宝母指纹图谱相像度较好，建立了同一种属的珍宝母经水解后的HPLC指纹图谱。 4.4 采纳凯氏定氮法和试验色谱条件所建立的珍宝母水解液指纹图谱，可基本实现对珍宝母定量与定性，局部与整体限制，这样，可全面反映药材的整体质量。同时，该方法为其它中药材的质量限制供应了一种思路。 参考文献： 1 徐燕等. 清开灵注射液和珍宝母水解液中钙的测定及形态初探J. 中成药，2003，25（2）:106-109. 2 赵希贤，杨抒宁，彭澍. 珍宝母水解提取氨基酸工艺的初步探讨J. 北京中医药高校学报，2005,28（5）:54-56. 3 李桂萍.不同品种珍宝母中氨基酸的含量测定.北京中医药高校学报J. 1994, 17(1): 60-63. 4 国家药品监督管理局. 关于印发中药注射剂指纹图谱探讨的技术要求（暂行）的通知 注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文