第五章--转基因动物与生物反应器OK..优秀PPT.ppt

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1、第五章第五章 转基因动物与生物反应器转基因动物与生物反应器将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺当完成胚胎发育；接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺当完成胚胎发育；移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转 入的外源基因；入的外源基因；利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。将特定的目的基因从某一生物体分别出来，进行扩增和加将特定的目的基

2、因从某一生物体分别出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物称后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物称为转基因动物（为转基因动物（transgenetic animal）。）。外源目的基因的制备外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择获得携有目的基因的细

3、胞选择合适的体外培育系统和宿主动物选择合适的体外培育系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系筛选所得的转基因动物品系第一节第一节 目的基因的制备目的基因的制备一、目的基因的来源一、目的基因的来源1.接受限制性内切酶，从生物组织中获得目的基因；接受限制性内切酶，从生物组织中获得目的基因；2.通过通过mRNA合成合成cDNA；3.人工合成的人工合成的DNA片段；片段；4.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。）扩增特定基因片段。二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆通过载体在适当的宿主中克隆通过载体在适当的宿主中克隆选择载体目的基因与

4、载体的连接重组体导入受体细胞通过通过PCR反应克隆目的基因反应克隆目的基因三、目的基因的转移三、目的基因的转移u电穿孔法电穿孔法u显微注射法显微注射法u袒露袒露DNA干脆注射干脆注射u磷酸钙磷酸钙DNA共沉淀法共沉淀法u脂质载体包埋法脂质载体包埋法u病毒介导的生物学方法病毒介导的生物学方法电穿孔法实现外源基因的转移电穿孔法实现外源基因的转移利用脉冲电场提高细胞膜的利用脉冲电场提高细胞膜的利用脉冲电场提高细胞膜的利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源通透性，从而使外源通透性，从而使外源通透性，从而使外源DNADNA转转转转移至细胞中。此法简洁、效移至细胞中。此法简洁、效移至细胞中。此法简洁、

5、效移至细胞中。此法简洁、效率较高，广泛应用于培育细率较高，广泛应用于培育细率较高，广泛应用于培育细率较高，广泛应用于培育细胞的基因转移。胞的基因转移。胞的基因转移。胞的基因转移。显微注射转基因技术显微注射转基因技术利用显微操作技术转移外利用显微操作技术转移外利用显微操作技术转移外利用显微操作技术转移外源基因的方法。源基因的方法。源基因的方法。源基因的方法。此法转入此法转入此法转入此法转入基因长度可达数百基因长度可达数百基因长度可达数百基因长度可达数百kbkb；并；并；并；并能随机地整合在受体细胞能随机地整合在受体细胞能随机地整合在受体细胞能随机地整合在受体细胞染色体染色体染色体染色体DNADN

6、A上，因此应用上，因此应用上，因此应用上，因此应用范围广。但是这种整合有范围广。但是这种整合有范围广。但是这种整合有范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因时会导致转基因动物基因时会导致转基因动物基因时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或组的重排、易位、缺失或组的重排、易位、缺失或组的重排、易位、缺失或定点突变。定点突变。定点突变。定点突变。磷酸钙磷酸钙DNA共沉淀法基因转移技术共沉淀法基因转移技术这种方法是受二价金属离这种方法是受二价金属离这种方法是受二价金属离这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸取外源子能促进细胞吸取外源子能促进细胞吸取外源子能促进细胞吸取外源DNADNA的启发而

7、发展起来的。的启发而发展起来的。的启发而发展起来的。的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙当核酸以磷酸钙当核酸以磷酸钙当核酸以磷酸钙DNADNA共共共共沉淀物的形式在时，细胞沉淀物的形式在时，细胞沉淀物的形式在时，细胞沉淀物的形式在时，细胞摄取摄取摄取摄取DNADNA的实力显著加强。的实力显著加强。的实力显著加强。的实力显著加强。但转移效率较低，仅有但转移效率较低，仅有但转移效率较低，仅有但转移效率较低，仅有1%5%1%5%的外源的外源的外源的外源DNADNA可以可以可以可以进入受体细胞核中，大约进入受体细胞核中，大约进入受体细胞核中，大约进入受体细胞核中，大约仅有仅有仅有仅有1%1%的的的的DN

8、ADNA可以在细可以在细可以在细可以在细胞中稳定表达。胞中稳定表达。胞中稳定表达。胞中稳定表达。脂质载体包埋法脂质载体包埋法将须要转移的外源将须要转移的外源将须要转移的外源将须要转移的外源DNADNA或或或或RNARNA包袱于脂质体内，由包袱于脂质体内，由包袱于脂质体内，由包袱于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结于脂质体具有磷脂双层结于脂质体具有磷脂双层结于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此构，与细胞膜类似，因此构，与细胞膜类似，因此构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，可以与受体细胞膜融合，可以与受体细胞膜融合，可以与受体细胞膜融合，从而将外源从而将外源从而将外源从而将外源DN

9、ADNA转入宿主转入宿主转入宿主转入宿主细胞。这种方法转基因效细胞。这种方法转基因效细胞。这种方法转基因效细胞。这种方法转基因效率高。率高。率高。率高。病毒介导的生物学方法病毒介导的生物学方法其次节其次节 转基因动物的方法转基因动物的方法反转录病毒法反转录病毒法基因显微注射法基因显微注射法胚胎干细胞移植法胚胎干细胞移植法一、基因的显微注射法一、基因的显微注射法何为显微注射？何为显微注射？显微注射就是借助光学显微镜的放显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，干脆把大作用，利用显微操作仪，干脆把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中

10、，然后生产动物个体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射的技术。经过显微注射DNA发育而成的发育而成的动物中，有少数整合了被注射的动物中，有少数整合了被注射的DNA分分子，成为转基因动物。子，成为转基因动物。通过激素疗法使小鼠超数排卵，起先时注射雌性妊娠血清，48小时后再注 射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般状况下5-10个，超 数排卵为35个；与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵；将经纯化的转基因样品快速注射入受精卵中变大的雄性原核内；将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；从小鼠子代体内取

11、出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位 点；子代小鼠间进行再交配，繁殖，视察转基因是否遗传及表达。DNADNA显微注射法的基本程序显微注射法的基本程序通过通过DNA显微注射获得转基因小鼠示图显微注射获得转基因小鼠示图（一）显微注射（一）显微注射DNA的制备与纯化的制备与纯化uDNA构型和末端结构u载体uDNA的长度与浓度u溶解DNA的缓冲液uDNA的纯度（二）鼠的准备与要求（二）鼠的准备与要求转基因鼠试验所用各类鼠转基因鼠试验所用各类鼠（三）超排卵与取卵（三）超排卵与取卵孕马血清（孕马血清（PMS）其有效成分为卵泡刺激素（）其有效成分为卵泡刺激素（FSH）。）。人绒毛膜促性腺激素（人

12、绒毛膜促性腺激素（hGG）雌鼠的排卵时间：PM10.0012.00雄鼠的排精时间：PM10.0012.00受精一般发生在：AM1.001 超排卵超排卵制定排卵程序：制定排卵程序：(1)于第一日中午先向小鼠腹腔内注入于第一日中午先向小鼠腹腔内注入5一一l 0单位的单位的PMS；(2)过过48小时小时(第三天中午第三天中午)腹腔内注入腹腔内注入510单位的人单位的人hCG(注射后注射后1113 小时小时 后排卵后排卵)；(3)令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两周后可再周后可再 重用，但成功率下降；重用，但成功率下降；

13、(4)检查阴栓检查阴栓(第四日晨第四日晨)；检查阴栓可判定是否受精；如已受精则出现；检查阴栓可判定是否受精；如已受精则出现阴栓。阴栓。2 受精卵的收集受精卵的收集(1)检查阴栓：有白色阴栓的小鼠可用，引颈处死动物：(2)取输卵管：剖开腹腔，取出输卵管，置入含有3ml培育液的60mm直径的瓶皿中；(3)取卵子；在20或50解剖镜下找到输卵管，在卵管膨大的壶腹部(于卵管开口近 处)隐隐可见内含的胚卵，把胚卵团用尖摄轻轻压挤出，用吸管移入含有400l分别 液的表玻皿中；(4)另准备45个瓶皿，每皿内均充有胚胎培育基400 l并覆盖有厚8mm硅烷油或液 体石蜡层(Fisher产，探讨用)，硅烷油和石蜡

14、巳预先在5%CO2中置371时做平衡 处理，覆硅烷油或石蜡层的目的是为防止培育液蒸发、散热和pH变更；(5)向含卵团表玻皿的分别液中加5 l新制备的透亮质酸酶(透亮质酸酶10mg1ml分 离液，Sigma产)，把胚卵团消化分散开；(6)当卵团散开后，马上把分散游离的卵细胞用吸管转移入培育皿中，通过硅油层接 种入任一培育液小滴中)，以清除酶的接着作用；(7)再依次通过皿内其余培育液小滴，以接着除掉酶和摆脱碎片(碎片能堵塞吸管口)，此时的卵己可用作DNA注射之用。（四）（四）DNA显微注射显微注射1制备持卵管与注射针制备持卵管与注射针2持卵管制备：在火焰灯上将微玻璃管拉成中间较细的约持卵管制备：在

15、火焰灯上将微玻璃管拉成中间较细的约510cm长的一段，其口径约长的一段，其口径约80120m，用玻璃刀将其，用玻璃刀将其在离颈部在离颈部2cm处切断，再把切口烧成如图形态，口径约处切断，再把切口烧成如图形态，口径约15 m。将尖部移近火焰喷灯略加热，用镊子轻触尖部适宜。将尖部移近火焰喷灯略加热，用镊子轻触尖部适宜位置，使变成如图所示角度。位置，使变成如图所示角度。3注射针的制备：由拉针器制成，针的口径应低于注射针的制备：由拉针器制成，针的口径应低于1 m。（1）硅烷油注入：取培育皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡 （厚约5mm）；（2）加培育基：通过硅烷油或石蜡层向培育皿底接种

16、培育液，以100l为单元的小滴 数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)；（3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培育液小滴中；（4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥，重悬于注射缓冲液中(含1mgDNAml)，使其最终浓度为：0.050.5mg/ml；（5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消 除末溶解物，防止堵塞注射管口；（6）把待注射用的DNA装入注射管中；2 DNA注射注射（7）在显微镜下把支持吸管转移到培育液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培育 液，仅令充入吸管末

17、端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继 之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中心部；（8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透亮带刺入胚卵 细胞膜内(小鼠胚卵直径约10m)，进而接着进针再刺入任一原核内（雄性原 核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注 射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射；注射细胞数量越多越好；（9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培育小滴中，使之与未注射细胞分开；待 注射结束后，把全部细胞均移入培育液中，置入温箱培育30分种；（10）镜下视察细胞，发觉有溶解死亡崩溃者弃掉。（五）体内接种（五）体内

18、接种（1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌鼠备用；（2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许培育液，排出后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔内成串)；最终仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并利于识别；（3）麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)；（4）剪出背肾部两侧毛，碘酒酒精消毒；（5）使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm；（6）轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见 成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有

19、胚 卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入 输卵管内；（7）把输卵管及四周组织送回腹腔内；（8）细致紧密缝合创口，（9）再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。（六）显微注射法获得转基因鼠的成活率（六）显微注射法获得转基因鼠的成活率优点：优点：转基因范围广，转移基因大，可达数百转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何且转基因不含任何 病毒基因组片段，确定平安病毒基因组片段，确定平安。缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不合导致转基因不 表达；整合位点随机会造成

20、转动物基因组表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺的重排、突变、易位缺 失等；需显微操作仪，技术性要求强。失等；需显微操作仪，技术性要求强。二、胚胎干细胞方法二、胚胎干细胞方法胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分别出来的，能在体外培育的一种高度未分化的多能干细胞。）分别出来的，能在体外培育的一种高度未分化的多能干细胞。它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。可以在体外进行人工培育，扩增，并能以克隆的形式保存。（一）ES细胞的建立与维持动物的准备：取受精之后动物的准备：取受精之后3

21、.5天的母鼠分别鼠胚。天的母鼠分别鼠胚。胚胎的分别和初培育：胚胎的分别和初培育：3.5天孕鼠天孕鼠 鼠断颈处死鼠断颈处死 解剖小鼠取出胚胎解剖小鼠取出胚胎 体外培育胚胎体外培育胚胎 46天后，离散天后，离散ICM。ICM的离散与的离散与ES的分别：分别的分别：分别ICM 酶解细胞团酶解细胞团 培育离散细胞培育离散细胞 ES细胞集落细胞集落ES细胞的扩增：离散细胞的扩增：离散ES细胞细胞 置四孔培育板中培育置四孔培育板中培育 ES细胞的常规培育：细胞的常规培育：ES细胞由四孔板转至培育皿进行常规培育细胞由四孔板转至培育皿进行常规培育（二）ES细胞的基因组操作 将外源基因移入到ES细胞基因组后，既

22、能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2）转入的目的基因（TG）编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor）两个不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）（三）转基因（三）转基因ES细胞的筛选细胞的筛选正负选择法正负选择法 正选择法筛选出转基因整合型正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：细胞：通过物理方法将重组通过物理方法将重组DNA分子导入分子导入ES细胞，细胞，在含有抗菌素在含有抗菌素G418的培育基中，没有整合外的培育基中，没有整合外

23、源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。因的细胞才可以存活下来。负选择法筛选出特异整合型负选择法筛选出特异整合型ES细胞：细胞：假如非特异性整合发生，则两个假如非特异性整合发生，则两个tk基因或基因或其中一个基因很大可能与其中一个基因很大可能与TG和和neor一起整合，一起整合，这时用这时用GCV筛选，筛选，tk基因表达的胸苷激酶能反基因表达的胸苷激酶能反GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是负选反择。负选反择。（四）转基因（四）转基因ES细胞的检测细胞的检测（五）转基因小鼠的繁育（五）转基

24、因小鼠的繁育 正确整合的转基因胚胎干细胞经培育后就可以正确整合的转基因胚胎干细胞经培育后就可以移入胚泡期的供体胚胎了。将这些胚胎移植到假孕移入胚泡期的供体胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。（六）获得纯合的转基因鼠优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。缺点：须要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产 仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件 须要大量资金投入的事情。三、反转录病毒法（一）反转录病毒感染法的原理（一）反转录病毒感染法的原理反转录病毒单链RNA分子；病毒进入细胞后，RNA编码出反转录酶；病

25、毒RNA反转录为双链分子；DNA整合到宿主细胞DNA中。（二）反转录病毒感染法的载体的构建提取病毒未整合的环状形式DNA；将环状DNA克隆到适当的载体中；选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；将外源目的基因克隆到载体中（三）通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞 反转录病毒载体的工作原理：寄生在受体细胞中的重组病毒由于没反转录病毒载体的工作原理：寄生在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒有包装信号，能生产病病毒RNA和全部蛋白质，但不能包装成病毒和全部蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号

26、将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。四、重组反转录病毒感染早期胚胎四、重组反转录病毒感染早期胚胎优优点点：能能有有效效地地将将转转基基因因整整合合入入受受体体细细胞胞的的基基因因组组内内，单拷贝整合型；转单拷贝整合型；转 基基因因整整合合后后能能稳稳定定地地遗遗传传；整整合合机机制制相相应应明明确，在确，在TR区域内进区域内进 行，不会破坏转基因结构行，不会破坏转基因结构 缺缺点点：载载量量较较小小，一一般般只只有有8kb，可可能能会会因因缺缺少少必必需需的的调控元件而影响转调控元件而影响转 基基因因表表达达；尽尽管管病病毒毒载载体体被被设设计计为为复复

27、制制缺缺陷陷型的，但在包装细胞的型的，但在包装细胞的 包包装装过过程程中中，若若与与整整合合型型协协助助表表达达基基因因组组发发生同源重组，就有可能生同源重组，就有可能 组组装装成成野野生生型型逆逆转转录录病病毒毒颗颗粒粒，因因此此在在构构建建具有商业价值的转基因具有商业价值的转基因 动物时，一般运用受到限制。操作繁琐。动物时，一般运用受到限制。操作繁琐。第三节第三节 转基因动物的检测转基因动物的检测uDNA的提取的提取u斑点杂交和斑点杂交和PCR扩增扩增uSouthern杂交杂交uNorthern杂交杂交u表达产的检测表达产的检测第四节第四节 转基因动物探讨现状转基因动物探讨现状一、转基因牛

28、一、转基因牛从屠宰场杀掉的奶牛体内收集从屠宰场杀掉的奶牛体内收集 卵母细胞，并使之在体外成熟卵母细胞，并使之在体外成熟用公牛精液对成熟卵母细胞进用公牛精液对成熟卵母细胞进 行体外受精；行体外受精；受精卵离心，浓缩卵黄；受精卵离心，浓缩卵黄；将欲导入的将欲导入的DNA微注射到桔前微注射到桔前 核当中；核当中；对胚胎进行体外培育；对胚胎进行体外培育；利用非外科移植术将一个胚胎利用非外科移植术将一个胚胎 植入发情的代孕母牛子宫内；植入发情的代孕母牛子宫内；对于代进行州对于代进行州A检测，确定是检测，确定是 否存在转人基因。否存在转人基因。二、转基因绵羊、山羊和猪二、转基因绵羊、山羊和猪在山羊奶中生产

29、在山羊奶中生产ATT三、转基因禽类三、转基因禽类四、转基因鱼四、转基因鱼第五节第五节 转基因动物的应用转基因动物的应用一、转基因动物在生命科学基础探讨中的应用一、转基因动物在生命科学基础探讨中的应用探讨基因的结构与功能探讨基因的结构与功能探讨基因的组织特异性表达探讨基因的组织特异性表达探讨发育相关基因的表达与调控探讨发育相关基因的表达与调控克隆在发育中起重要作用的基因克隆在发育中起重要作用的基因基因多级调整系统的探讨基因多级调整系统的探讨细胞功能探讨细胞功能探讨基因敲除（基因敲除（gene knock out），是指对一个结构已知但功），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计试验

30、，将该基因去除，或能未知的基因，从分子水平上设计试验，将该基因去除，或用其它依次相近基因取代，然后从整体视察试验动物，推想用其它依次相近基因取代，然后从整体视察试验动物，推想相应基因的功能。这与早期生理学探讨中常用的切除部分相应基因的功能。这与早期生理学探讨中常用的切除部分视察整体视察整体推想功能的三部曲思想相像。推想功能的三部曲思想相像。基因敲除的技术路途如下：基因敲除的技术路途如下：（1）构建重组基因载体）构建重组基因载体（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞转入受体细胞核内核内（3）用选择培育基筛选已击中的细胞）用选择培育基筛选已击中的细胞

31、（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态视察及分子生物学检测。因动物进行形态视察及分子生物学检测。二、转基因动物在医药探讨领域中的应用二、转基因动物在医药探讨领域中的应用探讨病毒性疾病探讨病毒性疾病探讨建立人类疾病的转基因动物模型探讨建立人类疾病的转基因动物模型转基因动物与基因治疗转基因动物与基因治疗生产自然活性药物蛋白生产自然活性药物蛋白第六节第六节 转基因动物探讨存在的问题转基因动物探讨存在的问题转基因动物的低效性转基因动物的低效性转入基因造成宿主基因突变问题转入基因造成宿主基因突变问题转入基因的表达问题转入基因

32、的表达问题病毒转基因探讨存在的问题病毒转基因探讨存在的问题转基因动物模型与预期不符问题转基因动物模型与预期不符问题乳腺生物反应器的问题乳腺生物反应器的问题社会问题社会问题第七节 动物生物反应器 一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要便利产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的探讨最为引人注目。一一、动物血液生物反应器动物血液生物反应器

33、 外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。大家畜的血液容量较大大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产某些蛋白质或多利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了确定进展。外源基因编码产物可干脆从血肽等药物己取得了确定进展。外源基因编码产物可干脆从血清中分别出来清中分别出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。血细胞组分可通过裂解细胞获得。二、动物膀胱生物反应器二、动物膀胱生物反应器 外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器。叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿

34、血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。三、动物乳腺生物反应器三、动物乳腺生物反应器 动物乳腺生物反应器利用哺乳动物动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物动物,指导外源基因在乳腺中表达指导外源基因在乳腺中表达,并从并从转基因动物的乳液中获得重组蛋白。转基因动物的乳液中获得重组蛋白。1.动物乳腺生物反应器的制备动物乳腺生物反应器的制备（1）表达载体的构建 目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定

35、位表达调控元件：第一类是B2乳球蛋白(BL G)，其次类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。（2）目的基因的选择）目的基因的选择 选择目的基因的基本要求是，正常状况下浓度低、翻选择目的基因的基本要求是，正常状况下浓度低、翻译后修饰困难、其它表达体系难以表达或表达量低、应用译后修饰困难、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广袤的蛋白基因。前景广袤的蛋白基因。（3）体外重组）体外重组 选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。建融合基因。（4）基因转导）基因转导 将构建

36、好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。（5）胚胎移植）胚胎移植 利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁采集转基因动物的乳汁,来获得目的基因表达产物。来获得目的基因表达产物。（6）鉴定）鉴定 转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。泌物两个方面进行鉴定。2.动物乳腺生物反应器的优点动物乳腺生物反应

37、器的优点u产品质量稳定产品质量稳定u产品成本低产品成本低u研制开发周期短研制开发周期短u无污染无污染u经济效益显著经济效益显著在山羊奶中生产在山羊奶中生产ATT3.动物乳腺生物反应器的应用动物乳腺生物反应器的应用u高乳汁养分价值高乳汁养分价值u生产药用蛋白生产药用蛋白 4.动物乳腺生物反应器存在的问题动物乳腺生物反应器存在的问题（1）外源基因在动物体内的位点整合问题）外源基因在动物体内的位点整合问题（2）乳蛋白基因表达组织特异性问题）乳蛋白基因表达组织特异性问题（3）目的蛋白的翻译后修饰问题）目的蛋白的翻译后修饰问题（4）转基因表达产物的分别和纯化问题）转基因表达产物的分别和纯化问题（5）转基因的技术与方法问题）转基因的技术与方法问题（6）伦理道德问题）伦理道德问题