荧光定量PCR技术原理、方法、数据分析详述优秀PPT.ppt

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1、不同样品核酸提取、扩增、荧光定不同样品核酸提取、扩增、荧光定量量PCR完备解决方案完备解决方案北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路1515号）号）Fax：010-62951781 Tel：010-62951781 62983458 62979408 :/bioteke E-mail:infobioteke 不同样品核酸提取、扩增、荧光定不同样品核酸提取、扩增、荧光定量量PCR完备解决方案完备解决方案-核酸提取攻略核酸提取攻略北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路1515

2、号）号）不同样品不同样品RNARNA提取最适方法提取最适方法RNARNA纯度与质量考察纯度与质量考察RNARNA提取常见问题及解决方案提取常见问题及解决方案常见样品常见样品DNADNA提取提取特殊样品特殊样品DNADNA提取提取DNADNA分别纯化中常见问题分析分别纯化中常见问题分析内容概要内容概要样品样品裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨或其他方法处理或其他方法处理抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解或洗脱或洗脱离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀或介质吸附或介质吸附RNA提取流程提取流程沉淀法：沉淀法：异丙醇或乙醇介质吸附法：介质吸附法：RNA提取常用方法提取常用方法-沉淀方法沉

3、淀方法吸附材料吸附材料原理原理硅基质硅基质高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱磁珠磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附并携带RNA异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法苯酚法在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的释放出来的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而分别位下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分别；于整个体系中的中间相和水相，从而得以分别；有机溶剂抽提，沉淀

4、，得到纯净有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNARNA。RNA提取常用方法提取常用方法-裂解方式裂解方式胍盐胍盐 /-/-巯基乙醇巯基乙醇盐酸胍裂解样本，抑制 RNase 的活性；-巯基乙醇变性蛋白 BioTeke的的RNA提取试剂具有明显的优势提取试剂具有明显的优势在经典试剂的基础上，不断升级。在经典试剂的基础上，不断升级。多款高品质的多款高品质的RNA提取试剂：提取试剂：Tri pure（Trizol）RNApure（Trizol法的升级产品）法的升级产品）组织组织/细胞样品细胞样品RNARNA提取提取材料：材料：材料：材料：小鼠肝脏组织小鼠肝脏组织方法：方法：方法：方法：BioTeke RN

5、Apure高纯总高纯总RNA 快速提取试剂盒快速提取试剂盒 0.1g样品组织样品组织结结结结果：果：果：果：图：小鼠肝脏组织图：小鼠肝脏组织RNA RNA 1 2 3 4RNApure RNApure RNApure RNApure 高纯总高纯总高纯总高纯总RNARNARNARNA快速提取试剂快速提取试剂快速提取试剂快速提取试剂 1 2 3图片说明：1 BioTeke RNAclean2 BioTeke TRIpure(TRIzol法)3 BioTeke RNApure 离心柱型(注：本图试验材料为植物叶片）同一样品基因组同一样品基因组DNA和和RNA分提分提原理：原理：依据基因组依据基因组D

6、NADNA和和RNARNA在硅基质膜上的结合在硅基质膜上的结合条件不同，用两根离条件不同，用两根离心吸附柱分别提取基心吸附柱分别提取基因组因组DNADNA和和RNARNA。特殊样品特殊样品RNARNA提取提取-血液血液图1全血样品溶解在TRI pure LS Reagent试剂后的状态图2泳道1与2，在-80度保存一个月后的提取结果。M泳道：标准的Hela细胞RNA材料：材料：材料：材料：松针、冬青、香蕉、木菠萝和杨树松针、冬青、香蕉、木菠萝和杨树方法：方法：方法：方法：通用植物总通用植物总RNA提取试剂盒提取试剂盒（离心柱型）（离心柱型）0.1g样品组织样品组织结结结结果：果：果：果：得率：

7、约得率：约35-4035-40g 纯度：纯度：OD260/OD280OD260/OD280 图片说明：图片说明：1 1、2 2 杨树；杨树；3 3、4 4 香蕉；香蕉；5 5、6 6 松针；松针；7 7、8 8 冬青；冬青；9 9、10 10 木菠萝木菠萝 多糖多酚植物样品多糖多酚植物样品RNARNA的提取的提取1 2 3 4 5 6 7 8 9 10试剂试剂试剂试剂盒适用范盒适用范盒适用范盒适用范围围围围：水稻种子、小麦种子、玉米种子、高粱种水稻种子、小麦种子、玉米种子、高粱种子、拟南芥种子、大豆种子、苹果、葡萄、子、拟南芥种子、大豆种子、苹果、葡萄、香蕉、棉花、龙眼、荔枝、各种草坪牧草香蕉

8、、棉花、龙眼、荔枝、各种草坪牧草植物、各种树木、各种花卉等绝大多数植植物、各种树木、各种花卉等绝大多数植物物图片说明：1、2DNA和大RNA；3、4Micro RNA(材料为小鼠肝脏组织)Micro RNAMicro RNA提取提取1 2 3 4提取原理：提取原理：传统方法：先提取总RNA然后跑胶回收或沉淀Micro RNA。新方法：通过裂解液裂解和酸酚分层后过柱两次，一次去除基因组DNA和大片段RNA，后一次吸附Micro RNA，然后漂洗收集。新方法特点：新方法特点：高效分别小高效分别小RNARNA，同时分别总，同时分别总RNARNA可用于可用于miRNAmiRNA、siRNAsiRNA和

9、和snRNAsnRNA的分析的分析适用各种来源的样品适用各种来源的样品提取时间短，约提取时间短，约3030分钟完成试验分钟完成试验生物大分子具有共轭双键，在生物大分子具有共轭双键，在260260和和280nm280nm波特长有光吸取波特长有光吸取峰。峰。纯度：紫外分光光度计测定所提总纯度：紫外分光光度计测定所提总RNARNA在在260nm260nm和和280nm280nm波特波特长的光吸取，以长的光吸取，以A260/A280A260/A280的比值来推断总的比值来推断总RNARNA的纯度。的纯度。质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。RNARNA纯度与质量考察纯度

10、与质量考察RNARNA提取常见问题及解决方案提取常见问题及解决方案RNA RNA 的降解的降解 OD260/OD280 OD260/OD280 比值偏低比值偏低电泳带型异样电泳带型异样下游试验效果不佳下游试验效果不佳RNA的降解的降解簇新细胞或组织：簇新细胞或组织：裂解液的质量裂解液的质量外源外源RNaseRNase的污染的污染裂解液的用量不足裂解液的用量不足组织裂解不充分组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等如脾脏，胸腺等)，很，很难避开难避开 RNA RNA 的降解。的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时运用更多建议在液氮条件下将组织碾碎，并

11、且匀浆时运用更多裂解液。裂解液。RNA的降解的降解冷冻样品：冷冻样品：样品取材后应马上置于液氮中速冻，然后可以移至样品取材后应马上置于液氮中速冻，然后可以移至-70-70冰冰箱保存。样品要相对小一点；箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避开溶化，研磨用具必需预冷，样品与裂解液充分接触前避开溶化，研磨用具必需预冷，研磨过程中刚好补充液氮。研磨过程中刚好补充液氮。RNA的爱护的爱护采集样品的爱护：采集样品的爱护：通常用液氮保存通常用液氮保存样品爱护剂样品爱护剂RNAfixer,样品浸泡其中可以在样品浸泡其中可以在37保存一天，

12、保存一天，25一周，一周，4一个月，一个月，-20一年左右。一年左右。环境中环境中RNase的清除：的清除：DEPC处理各种试验器具处理各种试验器具RNAsafe对溶液中对溶液中RNase进行清除。进行清除。RNA酶喷雾清除剂，可对固体表面的酶喷雾清除剂，可对固体表面的RNase起到清除的作起到清除的作用，更大程度上避开用，更大程度上避开RNase的污染。的污染。蛋白质污染：蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。心分层的离心力和时间要足够。削减起始样品量，确保裂解完全、彻底削减起始样品量，确保

13、裂解完全、彻底解决方法解决方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。心分层的离心力和时间要足够。解决方法解决方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280 比值偏低比值偏低OD260/OD280 比值偏低比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75%乙醇。解决方法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10-

14、0.50 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD 时，比照及样品稀释液请运用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。非变性电泳：上样量超过 3g，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合实力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。电泳条带异样电泳条带异样抽提试剂的残留 75%乙醇洗涤 样品中杂质的残留多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 运用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA 下游试验效果不佳（下游试验效果不佳（RNARNA降解）

15、降解）不同样品基因组不同样品基因组DNADNA提取提取常见样品基因组常见样品基因组DNADNA提取提取细胞细胞/组织组织/细菌细菌/血液基因血液基因DNADNA提取提取植物材料植物材料DNADNA提取提取特殊样品基因组特殊样品基因组DNADNA提取提取大量血液样品大量血液样品DNADNA提取提取环境微生物环境微生物DNADNA提取提取临床样本临床样本DNADNA提取提取DNADNA分别纯化中的常见问题分析分别纯化中的常见问题分析基因组基因组DNADNA提取流程提取流程化学方法CTAB法：适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂，溶解细胞膜，与核酸结合。在高盐下溶说明放DNA。SDS法：适用于血液，

16、细胞，动物组织，细菌，酵母等物理方法 机械剪切，超声波裂开，研磨匀浆等。易造成DNA断裂。酶法 蛋白酶KBioTeke基因组DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法基因组基因组DNADNA提取流程提取流程-细胞裂解细胞裂解特点：特点：特点：特点：不须要运用有毒的氯仿、不须要运用有毒的氯仿、不须要运用有毒的氯仿、不须要运用有毒的氯仿、苯酚等试剂苯酚等试剂苯酚等试剂苯酚等试剂多次柱漂洗确保高纯度；多次柱漂洗确保高纯度；多次柱漂洗确保高纯度；多次柱漂洗确保高纯度；长度可达长度可达长度可达长度可达30-50Kb30-50Kb30-50Kb30-50Kb提取原理：提取原理：提取原理：提取原理：组织组织/细胞

17、细胞/细菌细菌/血液基因组血液基因组DNADNA提取提取玉米叶片基因组玉米叶片基因组DNADNA提取提取（使用新型快速植物基因组（使用新型快速植物基因组DNADNA提取试剂盒）提取试剂盒）提取原理：提取原理：提取原理：提取原理：植物材料基因组植物材料基因组DNADNA提取提取特殊样品基因组特殊样品基因组DNADNA提取提取传统方法适用于全部材料基因组DNA的提取？比如大量血液？比如土壤/粪便中的微生物基因组DNA的提取？比如病毒及其他微量样品DNA的提取？NO！中量中量/大量血液基因组大量血液基因组DNADNA提取提取传统方法传统方法 消化后，用酚/氯仿抽提，时间长，损害操作人员健康BioTe

18、ke创新创新 不用蛋白酶消化 不用酚/氯仿抽提结果：结果：得率：约75-250g/5mL血样 纯度：OD260/OD2805ml5ml全血基因组全血基因组DNADNA提取电泳结果提取电泳结果土壤土壤/粪便微生物基因组粪便微生物基因组DNADNA提取提取其他品牌试剂盒存在缺点：其他品牌试剂盒存在缺点：接受玻璃珠或钢珠裂开，导致基因组断裂严峻；接受玻璃珠或钢珠裂开，导致基因组断裂严峻；必需购买裂开专用设备，增加运用成本；必需购买裂开专用设备，增加运用成本；接受包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致接受包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致DNADNA大量损失，得率很低，很难真实反映土壤微生

19、物的多样性。大量损失，得率很低，很难真实反映土壤微生物的多样性。BioTekeBioTeke的技术创新：的技术创新：接受酶法裂开，保证基因组的完整性；接受酶法裂开，保证基因组的完整性；用异丙醇沉淀用异丙醇沉淀DNADNA，DNADNA无损失。无损失。厂家厂家破碎破碎方式方式纯化纯化方式方式提取提取时间时间是否需要是否需要专门设备专门设备BioTeke酶法破碎基因组完整离心柱吸附杂质纯度高1小时内不需要Q公司钢珠破碎基因组断裂玻璃奶同离心柱结合得率低2小时需要M公司玻璃珠破碎基因组断裂离心柱纯化得率较低2小时需要临床样品基因组临床样品基因组DNADNA提取提取病毒基因组DNA提取酵母基因组DNA

20、提取口腔拭子DNA提取微量样品DNA提取石蜡组织DNA提取头发DNA提取一步法一步法DNADNA提取扩增提取扩增原理：原理：综合微量样品基因综合微量样品基因组组DNADNA提取和高效的提取和高效的PCRPCR扩增试剂。从毛扩增试剂。从毛发、石蜡组织等微发、石蜡组织等微量组织中高效提取量组织中高效提取足够浓度的足够浓度的DNADNA，然，然后进行后进行PCRPCR扩增。操扩增。操作简洁、便利，可作简洁、便利，可对大量样品同时进对大量样品同时进行操作。行操作。保证基因组保证基因组DNADNA的完整性和纯度的完整性和纯度提高提高DNADNA的洗脱效率的洗脱效率DNADNA的储存的储存基因组基因组DN

21、ADNA分别纯化中的留意事项分别纯化中的留意事项保证基因组保证基因组DNADNA的完整性和纯度的完整性和纯度提高提高DNADNA的洗脱效率的洗脱效率DNADNA的储存的储存基因组基因组DNADNA分别纯化中的留意事项分别纯化中的留意事项简化操作步骤，缩短操作时间削减物理因素对DNA的降解，震荡、搅拌等削减化学物质对DNA的降解，操作多在pH4-10防止基因组DNA的生物降解：DNase保证基因组保证基因组DNADNA的完整性和纯度的完整性和纯度提高提高DNADNA的洗脱效率的洗脱效率DNADNA的储存的储存基因组基因组DNADNA分别纯化中的留意事项分别纯化中的留意事项洗脱液65度预热10分钟

22、洗脱体积不小于30L洗脱2次或者3次保证基因组保证基因组DNADNA的完整性和纯度的完整性和纯度提高提高DNADNA的洗脱效率的洗脱效率DNADNA的储存的储存基因组基因组DNADNA分别纯化中的留意事项分别纯化中的留意事项可长期储存于pH=7.0的ddH2O或TE不易制成干品储存分装低温保存如何提高微量核酸提取或回收后的浓度如何提高微量核酸提取或回收后的浓度核酸助沉剂的应用核酸助沉剂的应用微量吸附柱的应用微量吸附柱的应用-15l洗脱体系洗脱体系质粒提取胶回收或PCR产物回收微量细胞/组织DNA/RNA提取病毒DNA/RNA提取微量临床样本DNA/RNA提取不同样品核酸提取、扩增、荧光不同样品

23、核酸提取、扩增、荧光定量定量PCR完备解决方案完备解决方案-Real-time qPCR攻略攻略北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路1515号）号）RT-PCR原理原理Real-time qPCR原理及应用原理及应用Real-time qPCR成功关键成功关键Real-time qPCR数据分析数据分析Real-time qPCR常见问题及解决方案常见问题及解决方案主要内容主要内容中心法则与中心法则与RTRT、PCRPCRRNADNARTPCR逆转录反应可以以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。提取RNA

24、的质量会影响到RT的产量及cDNA的完整性。整个过程要求无RNA酶操作。反转录酶、RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成确定的影响。反转录相关因素反转录相关因素Super M-MLV反转录酶反转录酶高效的逆转录活性，且无高效的逆转录活性，且无RNaseH活性活性Thermo M-MLV反转录酶反转录酶高效的逆转录活性，且无高效的逆转录活性，且无RNaseH活性活性适合合成长片段的适合合成长片段的cDNA,有很强有很强的模板兼容性，对高的模板兼容性，对高GC含量含量（75%以上）和结构困难的模板以上）和结构困难的模板效果显著效果显著在在42-60具有较好的热稳定性。具有较好的热稳定性。One ste

25、p RT-PCR模板：模板：模板：模板：运用运用运用运用BioTekeBioTekeBioTekeBioTeke公司的公司的公司的公司的RNApure RNApure RNApure RNApure 总总总总RNARNARNARNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组提取试剂盒提取的鸡肝脏组提取试剂盒提取的鸡肝脏组提取试剂盒提取的鸡肝脏组织织织织RNARNARNARNA 目的片段：目的片段：目的片段：目的片段：管家基因-Actin反应体系：反应体系：反应体系：反应体系：反应程序：反应程序：反应程序：反应程序：RT-PCR相关产品相关产品Super M-MLV反转录酶，反转录酶，10000u/198元元Su

26、per RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒50次，特价次，特价490元元Super One-step RT-PCR Kit 一步法一步法RT-PCR试剂盒试剂盒50次，特价次，特价880元元Thermo 系列产品买二赠一！系列产品买二赠一！Thermo M-MLV反转录酶，反转录酶，10000u/580元元Thermo RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒50次，价格次，价格1200元元Thermo One-step RT-PCR Kit 一步法一步法RT-PCR试剂盒试剂盒50次，价格次，价格1400元元反转录酶及试剂盒系列产品讲座期间特价实惠！反转

27、录酶及试剂盒系列产品讲座期间特价实惠！RT-PCR原理Real-time qPCR原理及应用Real-time qPCR成功关键Real-time qPCR数据分析Real-time qPCR常见问题及解决方案实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术的应用技术的应用基因表达差异分析基因表达差异分析拷贝数分析拷贝数分析SNPSNP检测检测miRNAmiRNA定量定量转基因成分定量分析转基因成分定量分析临床诊断、疾病及药物研发等临床诊断、疾病及药物研发等Real-time qPCR原理原理如何对初始模板定量如何对初始模板定量荧光信号如何产生？荧光信号如何产生？Real-Time qPCR主要概念主

28、要概念实时定量实时定量PCRPCR非探针非探针化学原理化学原理探针探针两个重要图形两个重要图形扩增曲线扩增曲线熔解曲线熔解曲线Real-Time qPCR曲线的意义曲线的意义扩增曲线熔解曲线图片为：首都医科高校演示试验结果 材料：小鼠肝脏 基因：-actin实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者特殊设计的引物(如LUX Primers)来指示扩增的增加。探针类(TaqMan探针和 分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但前者则简便易行。荧光染料和荧光探针

29、荧光染料和荧光探针SYBR Green I 工作原理工作原理SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增加。这一性质使其用于扩增产物的检测特别志向。SYBR GreenI的最大吸取波长约为497nm，放射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，放射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会放射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。LUX(light upon extention)LUX(light upon extention)引物是利

30、用荧光标记的引物实引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3 3 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的状况下，该引物端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的状况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。LUX 引物工作原理引物工作原理 TaqMan探针工作原理探针工作原理FQPrimerFQPrimerDegradation of T

31、aqMan probe by DNA polymeraseFQReporterQuencherSuppression of fluorescence分子信标分子信标（molecular beacon）工作原理工作原理 分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必需特别细致的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板

32、存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象变更使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图5）。荧光阈值荧光阈值(Threshold)Ct Ct值是扩增DNA的量达到阈值时候的循环次数。Ct 值与起始模板的关系探讨表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。CtCt值值Real-time qPCR流程流程一步法一步法两步法两步法优点

33、节省时间稳定性好减少污染灵敏度高定量相对准确缺点灵敏度稍差稳定性稍差操作稍复杂一步法和两步法优缺点比较一步法和两步法优缺点比较依据自己需求，选择合适的方法！依据自己需求，选择合适的方法！RT-PCR原理Real-time qPCR原理及应用Real-time qPCR成功关键Real-time qPCR数据分析Real-time qPCR常见问题及解决方案Real-time qPCR成功因素成功因素引物设计：引物设计：3末端尽量不是末端尽量不是A；1824bp；扩增产物；扩增产物80-150bp;设计在基因保守区内设计在基因保守区内 Taqman探针：尽量靠在上游引物；长度探针：尽量靠在上游引

34、物；长度3045bp，Tm比引物高至少比引物高至少 5；5端不要是端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量会有淬灭作用，影响定量RNA质量和定量质量和定量 比较好，比较好，2条主带可见（条主带可见（28s和和18s）；定量精确）；定量精确内标（内标（housekeeping gene）正确选择）正确选择 18s rRNA,-actin,GAPDH等等 标准曲线的精确制作标准曲线的精确制作R20.99反应体系：反应体系：模板浓度不要太高，反转录最多模板浓度不要太高，反转录最多1g1g总总RNARNA，PCR PCR一般一般1L1L反转录产物；反转录产物；引物浓度一般引物浓度一般100nM-1mM10

35、0nM-1mM；依据依据kitkit要摸索最佳反应条件要摸索最佳反应条件当心操作：当心操作：每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样，每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样，即使是混即使是混 合液！每个样品至少要做合液！每个样品至少要做3 3个平行孔。每个平行孔。每组试验最好有组试验最好有3 3个重复，做统计个重复，做统计分析。分析。Real-time qPCR成功因素成功因素做做real-time qRT-PCR前，做个一般的前，做个一般的PCR，检测您的反应条件！，检测您的反应条件！RT-PCR原理Real-time qPCR原理及应用Real-time qPCR成功关键

36、Real-time qPCR数据分析Real-time qPCR常见问题及解决方案Real-time qPCR数据分析数据分析基线（基线（baseline）通常是通常是315个循环的荧光信号个循环的荧光信号同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线阈值（阈值（threshold)自动设置是自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的10倍倍手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清晰地看到荧光信号明显增加。手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清晰地看到荧光信号明显增加。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，同一次反应中针对不同的基

37、因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增确定要用同一个阈值。但对于同一个基因扩增确定要用同一个阈值。Ct值值:与起始浓度的对数成线性关系与起始浓度的对数成线性关系分析定量时候一般取分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不精确。太大或者太小都会导致定量的不精确。统计分析方法统计分析方法确定定量：确定定量：此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒较，从而得到目的基因的量

38、。该标准品可以是纯化的质粒DNADNA，体外转录的，体外转录的RNARNA，或者是体外合成的，或者是体外合成的ssDNAssDNA。相对定量：相对定量：通过与内参基因通过与内参基因CtCt值之间的相差来计算基因表达差异值之间的相差来计算基因表达差异,一一般是般是 2-2-Ct Ct。或者是考虑扩增效率的。或者是考虑扩增效率的PfafflPfaffl法。法。确定定量确定定量相对定量相对定量Marisa L.Wong and Juan F.Medrano:BioTechniques July 2005相对定量相对定量实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高须要样品少特异性高（Taqman）

39、精确定量Real-time qRT-PCR优点优点RT-PCR原理Real-time qPCR原理及应用Real-time qPCR成功关键Real-time qPCR数据分析Real-time qPCR常见问题及解决方案特异性 重复性 灵敏度其他问题常见问题探讨常见问题探讨扩增的特异性扩增的特异性引物？引物？Tm，重新设计引物，优化条件，重新设计引物，优化条件Tm重复性重复性-推断试验优劣的重要指标推断试验优劣的重要指标推断指标：主要为标准差（SD）和变异系数（CV）影响重复性的因素：PCR 反应扩增的效率：优化试验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。目的基因的初始浓度：运用初始浓度具有较高数

40、量级的样本或作平行孔。标准曲线的影响：不少于5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；志向的标准品应与样本具有高同源性，质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA。影响灵敏度的因素影响灵敏度的因素反应体系中形成的引物二聚体的影响反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替可以用水解探针代替SYBR Green ISYBR Green I，有文献报导运用水解，有文献报导运用水解探针的敏感性要比探针的敏感性要比SYBR Green ISYBR Green I高出高出1010倍。倍。可以运用热启动方法或运用特殊处理的可以运用热启动方法或运用特殊处理的TaqTaq酶酶要尽

41、可能地优化引物设计要尽可能地优化引物设计假如反应体系中出现假如反应体系中出现PCRPCR的抑制因素，应适当将目的基因的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。的浓度稀释后再进行扩增。留意避开室温混合各种试剂，并且在一经混合后马上起先留意避开室温混合各种试剂，并且在一经混合后马上起先进行扩增。进行扩增。循环数循环数 Mg2Mg2的浓度的浓度 Q1:Q1:无无CtCt值（信号）出现值（信号）出现可能性可能性不大不大l检测荧光信号的步骤有误检测荧光信号的步骤有误:一般一般SG法接受法接受72延长时采集，延长时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延长结束采集信号。法则一般在退火结束时或延

42、长结束采集信号。l引物或探针降解引物或探针降解:可通过可通过PAGE电泳检测其完整性。电泳检测其完整性。l模板量不足模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。l模板降解模板降解:避开样品制备中杂质的引入及反复冻融的状况。避开样品制备中杂质的引入及反复冻融的状况。Q2:CtQ2:Ct值出现过晚（值出现过晚（CtCt3838）l扩增效率低扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓

43、度等。lPCR各种反应成分的降解或加样量的不足。各种反应成分的降解或加样量的不足。lPCR产物太长产物太长:一般接受一般接受80-150bp的产物长度。的产物长度。Q3:Q3:标准曲线的线性关系不佳标准曲线的线性关系不佳l加样存在误差加样存在误差:使得标准品不呈梯度。使得标准品不呈梯度。l标准品出现降解标准品出现降解:应避开标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。应避开标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。l引物或探针不佳引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针重新设计更好的引物和探针l模板中存在抑制物，或模板浓度过高。模板中存在抑制物，或模板浓度过高。Q4:Q4:阴性比照也出现明显的起飞阴

44、性比照也出现明显的起飞l反应反应mix或水被污染。或水被污染。l引物二聚体的出现：引物二聚体的出现：用用SG法在法在35cycles以后阴性出现起飞属正常状况，以后阴性出现起飞属正常状况，可协作熔解曲线进行分析。可协作熔解曲线进行分析。l反应过程中探针的降解：用反应过程中探针的降解：用PAGE电泳对探针进行检测。电泳对探针进行检测。lROX校正的问题：假如运用了，则可能是校正的问题：假如运用了，则可能是ROX的降解所造成。的降解所造成。Q5:Q5:熔解曲线不止一个主峰熔解曲线不止一个主峰l引物设计不够优化：应避开引物二聚体和发夹结构的出现。引物设计不够优化：应避开引物二聚体和发夹结构的出现。l

45、引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并留意上下游引物的浓度配比。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并留意上下游引物的浓度配比。l镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mixmix试剂盒。试剂盒。l模板有基因组的污染：模板有基因组的污染：RNARNA提取过程中避开基因组提取过程中避开基因组DNADNA的引入，或通过引的引入，或通过引物设计避开非特异扩增。物设计避开非特异扩增。Q6:Q6:扩增效率低扩增效率低l反应试剂中部分成分特殊是荧光染料降解。反应试剂中部分成分特殊是荧光染料降解。l反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法

46、。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。l反应体系中有反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，削减抑制物的影响。板适度稀释，再加入反应体系中，削减抑制物的影响。Q7:Q7:同样的试剂在不同仪器上产生不同的曲同样的试剂在不同仪器上产生不同的曲 线，如何比较？线，如何比较？推断标准：扩增效率，灵敏度，特异性推断标准：扩增效率，灵敏度，特异性BioTeke产品产品从根本上解决您的试验问题从根本上解决您的试验问题荧光定量荧光定量PCR试剂盒系列产品讲座期间特价实惠！试剂盒系列产品讲座期间特价

47、实惠！2SYBR real-time PCR premixture 荧光定量荧光定量PCR试剂盒试剂盒200次，特价次，特价890元元2SYBR real-time RT-PCR premixture反转录荧光定量反转录荧光定量PCR试剂盒试剂盒50次，特价次，特价1090元元One-step SYBR real-time RT-PCR Kit一步法荧光定量试剂盒一步法荧光定量试剂盒50次，特价次，特价1200元元BioTeke Real-time qPCR产品可用于各种仪器产品可用于各种仪器ABI:PRISM 7000/7700/7900HT,7300/7500Bio-Rad:DNA Eng

48、ine Option/DNA Engine Option2/Chromo4 Real time System,iCycler IQ/MyiQ/iQ5Stratagene:Mx3000P/Mx3005PRoche:Light cyclerBioer:Line-Gene其他各种real-time qPCR扩增仪ROXROX参考染料：在荧光检测中标准化非参考染料：在荧光检测中标准化非PCRPCR相关的震荡；相关的震荡；在在qPCRqPCR中供应一个稳定的基线中供应一个稳定的基线BioTeke Real-time qPCR产品反应程序产品反应程序两步扩增反应两步扩增反应 Real-time qPCR:

49、循环数循环数Step温度温度时间时间检测检测说明说明11952minOff起始模板预变性35-4519515secOff模板变性260-6820-60secOn退火/延伸三步扩增反应三步扩增反应 Real-time qPCR:循环数循环数Step温度温度时间时间检测检测说明说明11952minOff起始模板预变性35-4519510-20secOff模板变性255-6510-20secOff退火37220-60secOn延伸溶解程序：（溶解程序：（dissociation program),扩增反应完成后的最扩增反应完成后的最终一步，检测扩增反应的特异性。不同仪器要求的程序终一步，检测扩增反应

50、的特异性。不同仪器要求的程序略微不同。略微不同。ABI7000的溶解程序：的溶解程序：BioTeke Real-time qPCR产品反应程序产品反应程序循环数循环数Step温度温度时间时间检测检测1End55-6510-20secOnEnd9510-20secOffBioTeke产品应用实例产品应用实例-最权威的声音来源于实践最权威的声音来源于实践l目前应用最广泛的主流仪器：ABI系列及Bio-Rad系列。l来自Bio-Rad系列的检验报告。l来自ABI系列的检验报告。l我们都做得很好，我们始终在不断创新，力求解决您的试验需求。不同公司荧光定量试剂比较不同公司荧光定量试剂比较T公司公司Bio