第二十章--基因治疗优秀PPT.ppt

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1、第十三章第十三章基因治疗基因治疗一、基因治疗的一、基因治疗的概念概念及及遵循原则遵循原则二、二、基因治疗的程序基因治疗的程序三、三、基因治疗的策略基因治疗的策略四、四、基因治疗的临床应用基因治疗的临床应用五、五、基因治疗的问题与前景基因治疗的问题与前景六、裂解型六、裂解型（HSV-）载体用于脑肿瘤的基载体用于脑肿瘤的基因治疗因治疗(如图如图)基因治疗的概念n基因治疗基因治疗(genetherapy)就是将有功能的基因转移就是将有功能的基因转移到病人的细胞中以订正或置换致病基因的一种治疗方到病人的细胞中以订正或置换致病基因的一种治疗方法，是指有功能的目的基因导入靶细胞后与宿主细胞法，是指有功能的

2、目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，内的基因发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。若目的目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。若目的基因不与宿主细胞基因组发生整合，但可通过短暂表基因不与宿主细胞基因组发生整合，但可通过短暂表达产物发挥治疗作用的方法叫基因疗法（达产物发挥治疗作用的方法叫基因疗法（genetherapeutics），此法事实上就犹如临床上运用的），此法事实上就犹如临床上运用的药物治疗一样，这与传统意义上的基因治疗是有区分药物治疗一样，这与传统意义上的基因治疗是有区分的。基因治疗常实行四大措施，包

3、括：的。基因治疗常实行四大措施，包括：(1)基因置换基因置换(genereplacement)，(2)基因修正基因修正(genecorrection)，(3)基因修饰基因修饰(geneaugmentation)，(4)基因失活基因失活(geneinactivation)基因置换基因置换n基因置换基因置换(genereplacement)：是指将致：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。但操换，使致病基因永久地得到更正。但操作难度大，有伦理学问题。作难度大，有伦理学问题。基因修正基因修正n基因修正基因修正(genecorrect

4、ion)是指将致病是指将致病基因的突变碱基序列予以订正，而正常序基因的突变碱基序列予以订正，而正常序列部分予以保留，使突变的致病基因复原列部分予以保留，使突变的致病基因复原正常功能。即使得致病基因的突变序列订正常功能。即使得致病基因的突变序列订正为正常序列（用碱基点突变技术）。正为正常序列（用碱基点突变技术）。基因修饰基因修饰n基因修饰基因修饰(geneaugmentation)则是指则是指将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可修饰和变更缺陷细胞的基因的表达产物可修饰和变更缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。的功能或使原有的功能得到加强。基

5、因失活基因失活n基因失活基因失活(geneinactivation)就是应用就是应用反义技术反义技术(antisensetechnology)特异特异封闭某些基因的表达，以抑制或阻挡某些封闭某些基因的表达，以抑制或阻挡某些有害基因的表达。有害基因的表达。SiRNA的基因干扰可造的基因干扰可造成靶基因（异样基因）的失活（或缄默）。成靶基因（异样基因）的失活（或缄默）。基因治疗遵循的原则基因治疗遵循的原则基因治疗应遵循的基本原则为：基因治疗应遵循的基本原则为：1治疗的疾病应是指目前常规治疗方法难以阻挡疾病发治疗的疾病应是指目前常规治疗方法难以阻挡疾病发展的严峻疾病。展的严峻疾病。2遗传性疾病应是属

6、于染色体遗传性疾病应是属于染色体“隐性隐性”遗传的疾病，即遗传的疾病，即指来自双亲的二条染色体上同一基因位点都发生变更指来自双亲的二条染色体上同一基因位点都发生变更的疾病，只要通过导入同一正常基因即可订正缺陷。的疾病，只要通过导入同一正常基因即可订正缺陷。3能治疗疾病的正常基因已经被克隆，并能表达有功能能治疗疾病的正常基因已经被克隆，并能表达有功能的产物。的产物。4基因治疗用的基因在体内表达无需精确调控，表达产基因治疗用的基因在体内表达无需精确调控，表达产物过多不会产生危害。物过多不会产生危害。5注入体内带有外源基因的治疗细胞，应能自然消减去注入体内带有外源基因的治疗细胞，应能自然消减去除。除

7、。二、基因治疗的程序二、基因治疗的程序(一一)目的基因的准备目的基因的准备 (二二)受体细胞受体细胞(靶细胞靶细胞)的选择和培育的选择和培育 (三三)载体的选择载体的选择 (四四)目的基因导入靶细胞的基因转移方法目的基因导入靶细胞的基因转移方法 目的基因导入靶细胞的基因转移方法目的基因导入靶细胞的基因转移方法1基因转移的物理法基因转移的物理法2基因转移的化学法基因转移的化学法3基因转移的融合法基因转移的融合法4基因转移的颗粒轰击技术基因转移的颗粒轰击技术5基因转移的病毒载体法基因转移的病毒载体法1基因转移的物理法基因转移的物理法(1)显微注射法显微注射法真正的显微注射法：干脆在显微镜下向胞真正

8、的显微注射法：干脆在显微镜下向胞内注入基因。内注入基因。穿刺法：先在胞膜、胞核上穿孔，使基因穿刺法：先在胞膜、胞核上穿孔，使基因得以进入。得以进入。(2)电脉冲介导法（电穿孔法）：在高压电电脉冲介导法（电穿孔法）：在高压电脉冲下，使胞膜瞬间形成孔洞，基因在强脉冲下，使胞膜瞬间形成孔洞，基因在强电场下导入，电场强度和持续时间随种类电场下导入，电场强度和持续时间随种类而异。而异。2基因转移的化学法基因转移的化学法(1)DNA磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法(2)DEAE葡聚糖法葡聚糖法(3)染色体介导法染色体介导法(4)聚阳离子聚阳离子DMSO转染技术转染技术3基因转移的融合法基因转移的融合法(1)细

9、胞融合法细胞融合法(2)脂质体介导法脂质体介导法(3)原生质体融合法原生质体融合法(4)微细胞核介导法微细胞核介导法4基因转移的颗粒轰击技术（基因枪）基因转移的颗粒轰击技术（基因枪）n目的基因目的基因DNA质量较轻，在电场中不易获得较质量较轻，在电场中不易获得较高的运动速度，但用重金属钨或金等进行表面高的运动速度，但用重金属钨或金等进行表面包被以后，形成了有确定大小的颗粒，在电场包被以后，形成了有确定大小的颗粒，在电场突然充电时包被突然充电时包被DNA的金属颗粒可获得较大的的金属颗粒可获得较大的能量，并沿电场方向作快速运动，可穿入到器能量，并沿电场方向作快速运动，可穿入到器官、组织或培育的细胞

10、中，使外源目的基因官、组织或培育的细胞中，使外源目的基因DNA也随之穿入，即在电场作用下，也随之穿入，即在电场作用下，DNA金属金属颗粒发生高速运动，使颗粒发生高速运动，使DNA导入细胞中。转移导入细胞中。转移效率与颗粒大小、电场的电压有关。效率与颗粒大小、电场的电压有关。三、基因治疗的策略三、基因治疗的策略(一一)缺陷基因的基因置换疗法缺陷基因的基因置换疗法 (二二)基因修饰疗法基因修饰疗法 (三三)基因失活疗法基因失活疗法(一一)缺陷基因的基因置换疗法缺陷基因的基因置换疗法n缺陷基因的基因置换疗法就是以正常的基因置缺陷基因的基因置换疗法就是以正常的基因置换缺陷基因，而将细胞中原缺陷基因去除

11、后，换缺陷基因，而将细胞中原缺陷基因去除后，改用正常而有功能的基因进行替换，使缺陷或改用正常而有功能的基因进行替换，使缺陷或突变的基因在原位得到更正，此法可使单基因突变的基因在原位得到更正，此法可使单基因遗传病达到遗传病达到“治愈治愈”的最佳疗效，但目前尚不的最佳疗效，但目前尚不能用于临床治疗人类的遗传病，只能进行动物能用于临床治疗人类的遗传病，只能进行动物的试验探讨。若不需完整基因置换，而是使致的试验探讨。若不需完整基因置换，而是使致病基因的单个碱基发生突变，以正常的碱基订病基因的单个碱基发生突变，以正常的碱基订正致病基因中的某个突变碱基，也可使单基因正致病基因中的某个突变碱基，也可使单基因

12、遗传病得以永久治疗，此法又称基因修正疗法，遗传病得以永久治疗，此法又称基因修正疗法，但目前尚无基因修正的有力措施。但目前尚无基因修正的有力措施。(二二)基因修饰疗法基因修饰疗法n基因修饰疗法又称基因添加疗法，就是将基因修饰疗法又称基因添加疗法，就是将正常的基因导入病灶原发的细胞或其它细正常的基因导入病灶原发的细胞或其它细胞胞(如免疫细胞如免疫细胞)，其表达产物可以补偿或，其表达产物可以补偿或订正异样基因的功能，但异样的致病基因订正异样基因的功能，但异样的致病基因本身并未得到变更，仍保留在细胞中，此本身并未得到变更，仍保留在细胞中，此法导入的基因并非原位导入，因此，表达法导入的基因并非原位导入，

13、因此，表达水平和调控难以取得志向的结果，最志向水平和调控难以取得志向的结果，最志向的应是基因置换和基因修正策略。的应是基因置换和基因修正策略。(三三)基因失活疗法基因失活疗法n基因失活疗法是将遗传病或肿瘤等患者体基因失活疗法是将遗传病或肿瘤等患者体内过分表达异样产物的异样基因或癌细胞内过分表达异样产物的异样基因或癌细胞中与恶性程度有关的活化癌基因，使其受中与恶性程度有关的活化癌基因，使其受到抑制或封闭、甚至失活的疗法，以达到到抑制或封闭、甚至失活的疗法，以达到异样基因的表达受到抑制或封闭、甚至完异样基因的表达受到抑制或封闭、甚至完全停止，反义全停止，反义DNA/RNA及小及小RNA干扰技干扰技

14、术的抗肿瘤基因治疗是基因失活的志向方术的抗肿瘤基因治疗是基因失活的志向方法。法。四、基因治疗的临床应用四、基因治疗的临床应用（一）遗传性疾病的基因治疗（一）遗传性疾病的基因治疗（表（表13-213-2）（二）（二）肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗（三）（三）抗病毒的基因治疗抗病毒的基因治疗返回（二）肿瘤的基因治疗（二）肿瘤的基因治疗1目的基因的选择和治疗策略目的基因的选择和治疗策略2基因治疗方法基因治疗方法3细胞因子的基因治疗细胞因子的基因治疗4提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗1目的基因的选择和治疗策略目的基因的选择和治疗策略n肿瘤的基因治疗就是以正常的或野生型的基因肿

15、瘤的基因治疗就是以正常的或野生型的基因去取代不正常基因或阻挡异样基因的表达，以去取代不正常基因或阻挡异样基因的表达，以达到抑制或阻挡、甚至逆转肿瘤细胞恶性表现达到抑制或阻挡、甚至逆转肿瘤细胞恶性表现之治疗方法，因此目的基因的选择是很重要的。之治疗方法，因此目的基因的选择是很重要的。常选用的目的基因有：常选用的目的基因有：增加机体细胞免疫功增加机体细胞免疫功能、促进杀肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的免疫调能、促进杀肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的免疫调整和抗肿瘤作用的细胞因子基因如整和抗肿瘤作用的细胞因子基因如IL-2、IFN和集落刺激因子（和集落刺激因子（CSF）及）及MHC的的HLA-B7，HLA-DR基因

16、基因,抑癌基因如抑癌基因如P53，WT-1和和Rb三种基因，三种基因，原癌基因的反义原癌基因的反义DNA及及RNA和和SiRNA等。等。2基因治疗方法基因治疗方法（1）抑癌基因转移的基因治疗抑癌基因转移的基因治疗（2）反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法（3）药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用（4）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗如打破）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗如打破原先的肿瘤免疫的耐受，建立肿瘤特异免疫原先的肿瘤免疫的耐受，建立肿瘤特异免疫（5）多重耐药性基因转移的肿瘤基因多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗治疗（1）抑癌基因转移的基因治

17、疗）抑癌基因转移的基因治疗n抑癌基因或肿瘤抑制基因（抑癌基因或肿瘤抑制基因（TumorSuppressorgene）或血管形成抑制因子基因是肿瘤基因治疗）或血管形成抑制因子基因是肿瘤基因治疗中很重要的基因，这种基因导入肿瘤或其他细胞中很重要的基因，这种基因导入肿瘤或其他细胞后其表达产物可抑制肿瘤及肿瘤细胞的恶性增生、后其表达产物可抑制肿瘤及肿瘤细胞的恶性增生、血管形成等，甚至可以使恶性肿瘤细胞发生逆转血管形成等，甚至可以使恶性肿瘤细胞发生逆转而成为正常细胞，目前探讨和应用较多的抑癌基而成为正常细胞，目前探讨和应用较多的抑癌基因包括因包括P53、WT-1、Rb、Ango和和Endo等基因，等基因

18、，这些基因若发生突变、缺失或缺陷，易失去抑制这些基因若发生突变、缺失或缺陷，易失去抑制细胞恶性增生和血管形成的功能从而致癌，若导细胞恶性增生和血管形成的功能从而致癌，若导入上述基因的野生型进行基因修饰就可抑制癌细入上述基因的野生型进行基因修饰就可抑制癌细胞的恶性增生。胞的恶性增生。（2）反义寡核苷酸的反义寡核苷酸的原癌基因原癌基因失活疗法失活疗法n为了抑制肿瘤细胞中原癌基因的过高表达，可依为了抑制肿瘤细胞中原癌基因的过高表达，可依据已知原癌基因的核苷酸序列合成反义寡核苷酸，据已知原癌基因的核苷酸序列合成反义寡核苷酸，来抑制来抑制原癌基因的表达（因反义寡核苷酸能与原原癌基因的表达（因反义寡核苷酸

19、能与原癌基因核酸中的正链的特定依次互补结合形成双癌基因核酸中的正链的特定依次互补结合形成双链体）。反义寡核苷酸有以下几种：链体）。反义寡核苷酸有以下几种：n（1）反义）反义RNAn（2）具有核酶（）具有核酶（ribogyme）活性的反义）活性的反义RNAn（3）脱氧寡聚核苷酸（）脱氧寡聚核苷酸（oligodeoxyribonucleotides,ODN）n（4）肽核酸（）肽核酸（peitidenucleicacids,PNAS）原癌基因原癌基因n原癌基因（原癌基因（Proto-oncogene）是在亿万年漫长）是在亿万年漫长生物进化过程中高度保守的基因，说明原癌基生物进化过程中高度保守的基因，

20、说明原癌基因在细胞内是具有重要功能的，能调控细胞生因在细胞内是具有重要功能的，能调控细胞生长、增殖和分化。正常状况下其表达受到严格长、增殖和分化。正常状况下其表达受到严格的限制，一旦调整失控，其基因产物为生长因的限制，一旦调整失控，其基因产物为生长因子、生长因子受体、胞内外传递信号等就会出子、生长因子受体、胞内外传递信号等就会出现分泌过剩，过多的这些物质即成为致癌物质，现分泌过剩，过多的这些物质即成为致癌物质，常导致细胞恶性增生，细胞恶性转化与原癌基常导致细胞恶性增生，细胞恶性转化与原癌基因的活化亲密相关。原癌基因活化程度对肿瘤因的活化亲密相关。原癌基因活化程度对肿瘤的发生和发展具有重要的作用

21、，原癌基因活化的发生和发展具有重要的作用，原癌基因活化包括基因点突变、融合基因形成或异样激活后包括基因点突变、融合基因形成或异样激活后引起表达量异样等。引起表达量异样等。反义反义RNA技术技术 n反义反义RNA是一种与是一种与mRNA互补的互补的RNA分子，它分子，它是双链是双链DNA中无意义链转录的中无意义链转录的RNA，因此肿瘤，因此肿瘤癌基因活化表达的癌基因活化表达的mRNA的起始翻译部位就会被的起始翻译部位就会被相应的反义相应的反义RNA互补结合形成互补结合形成RNA/RNA双链体，双链体，进而就阻挡了核糖体与进而就阻挡了核糖体与mRNA结合，或阻挡核糖结合，或阻挡核糖体沿体沿mRNA

22、上移，以抑制上移，以抑制mRNA的翻译，起到了的翻译，起到了抑制癌基因过高表达癌蛋白的作用。反义抑制癌基因过高表达癌蛋白的作用。反义RNA技技术与补充基因转移疗法的常规技术相反，它走的术与补充基因转移疗法的常规技术相反，它走的是抑制基因（癌基因）表达的路途，是一种干涉是抑制基因（癌基因）表达的路途，是一种干涉性基因治疗，以阻挡或抑制原癌基因的过度表达性基因治疗，以阻挡或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体及抑制癌基因突变体mRNA的成熟，属基因失活的成熟，属基因失活疗法。疗法。具有核酶活性的反义具有核酶活性的反义RNA n在反义在反义RNA探讨的基础上，现又设计出具有核酶探讨的基础上，现又

23、设计出具有核酶（ribogyme）活性的反义）活性的反义RNA，它既能与，它既能与mRNA互补结合阻挡互补结合阻挡mRNA的翻译，同时其携带的锤头的翻译，同时其携带的锤头状结构基因能对靶序列（状结构基因能对靶序列（mRNA）进行特异性切）进行特异性切割，由此建立了核酶基因治疗新技术，这种核酶割，由此建立了核酶基因治疗新技术，这种核酶反义反义RNA可反复运用以降解可反复运用以降解mRNA，其抑癌效率，其抑癌效率明显高于反义明显高于反义RNA，这一技术为癌的基因治疗供，这一技术为癌的基因治疗供应了新技术、新思路，有较好的应用前景。应了新技术、新思路，有较好的应用前景。近来近来又发觉又发觉SiRNA

24、也能使其也能使其mRNA降解，可使肿瘤基降解，可使肿瘤基因缄默。因缄默。反基因技术反基因技术n反基因技术（反基因技术（antigene）,即依据癌基因序列制备即依据癌基因序列制备出脱氧寡聚核苷酸（出脱氧寡聚核苷酸（oligodeoxyribonucleotides,ODN）这种与癌基因互补的）这种与癌基因互补的ODN能以能以DNA双螺双螺旋分子专一性序列为靶物，与癌基因序列形成三旋分子专一性序列为靶物，与癌基因序列形成三螺旋螺旋DNA，这样就阻挡了癌基因的转录，因此就，这样就阻挡了癌基因的转录，因此就可在癌基因转录水平上阻挡癌基因的活化，有人可在癌基因转录水平上阻挡癌基因的活化，有人把三链把三

25、链DNA称为称为“能够攻击病毒和癌细胞而不损能够攻击病毒和癌细胞而不损害健康组织的新型基因药物害健康组织的新型基因药物”。反基因技术的关。反基因技术的关键在键在ODN的设计与合成，其作用机理是通过的设计与合成，其作用机理是通过ODN在在DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因（癌基结合蛋白的识别位点处，与靶基因（癌基因）形成三螺旋，可专一性地发挥干扰因）形成三螺旋，可专一性地发挥干扰DNA与蛋与蛋白的结合以及激活因子的转录起始或转录延长等白的结合以及激活因子的转录起始或转录延长等作用，进而阻挡癌基因的转录和高表达，达到作用，进而阻挡癌基因的转录和高表达，达到“反基因反基因”的目的。的目的。肽核酸肽

26、核酸n目前可通过计算机分析目前可通过计算机分析DNA结构，提出用结构，提出用多肽骨架结构取代多肽骨架结构取代ODN中的糖中的糖-磷酸骨架，磷酸骨架，并成功地合成了该分子，这种以肽为骨架并成功地合成了该分子，这种以肽为骨架的多酰基寡聚物称为肽核酸（的多酰基寡聚物称为肽核酸（peitidenucleicacids,PNAS），它保留了），它保留了ODN与与DNA的高度亲和力，因此能与靶基因形成的高度亲和力，因此能与靶基因形成三螺旋结构，尽管此项技术目前只是处于三螺旋结构，尽管此项技术目前只是处于试验探讨阶段，还有一些技术性问题尚待试验探讨阶段，还有一些技术性问题尚待解决，但终究会获得解决，应用潜力

27、极大。解决，但终究会获得解决，应用潜力极大。(3)药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用药物自杀基因的作用机理药物自杀基因的作用机理药物自杀基因的种类药物自杀基因的种类药物自杀基因作用的底物药物自杀基因作用的底物-GCV/ACV药物自杀基因靶向转移的特异性，如连接药物自杀基因靶向转移的特异性，如连接肿瘤相关抗原基因，肿瘤相关抗原基因，-FP针对肝癌，等等针对肝癌，等等药物自杀基因的临床应用前景药物自杀基因的临床应用前景药物自杀基因的作用机理药物自杀基因的作用机理 nHSV-tk基因编码的蛋白质含基因编码的蛋白质含376个氨基酸，个氨基酸，TK为胸苷激酶，为胸苷激酶

28、，是催化脱氧胸苷变成脱氧胸苷酸的酶，在细胞中是催化脱氧胸苷变成脱氧胸苷酸的酶，在细胞中TK的作用的作用底物范围较窄，而底物范围较窄，而HSV中的中的TK可催化一些核苷酸类似物可催化一些核苷酸类似物（NAs）的磷酸化，如）的磷酸化，如GCV、ACV等，对作用底物范围较等，对作用底物范围较宽，上述这些宽，上述这些NAs作为抗癌药不能在细胞作为抗癌药不能在细胞TK作用下磷酸化，作用下磷酸化，因此对未转染因此对未转染HSV-tk的细胞不起作用，但在导入和表达的细胞不起作用，但在导入和表达HSV-tk的细胞中，的细胞中，NAs可以被磷酸化，其磷酸化过程为可以被磷酸化，其磷酸化过程为NAsNAsMPNAs

29、DPNAsTP。NAsTP对细胞有猛烈对细胞有猛烈毒性，可抑制细胞毒性，可抑制细胞DNA聚合酶活性或作为三磷酸脱氧胸苷聚合酶活性或作为三磷酸脱氧胸苷（dTTP）的竞争性抑制物掺入到细胞合成的）的竞争性抑制物掺入到细胞合成的DNA内，使内，使细胞细胞DNA合成受抑或被阻断，进而导致细胞死亡（即凋亡）合成受抑或被阻断，进而导致细胞死亡（即凋亡）。药物自杀基因的种类药物自杀基因的种类 n除除HSV-tk基因为公认的药物自杀基因外，基因为公认的药物自杀基因外，还有水痘带状疱疹病毒的还有水痘带状疱疹病毒的tk基因（基因（VIV-tk）,大肠杆菌的大肠杆菌的DeoDa基因，细胞色素基因，细胞色素P-450

30、基因，黄嘌呤一鸟嘌呤核糖转移酶基因，黄嘌呤一鸟嘌呤核糖转移酶（XGPPT）等）等,均可将抗癌药均可将抗癌药NAs变为细变为细胞的毒性产物，抑制细胞胞的毒性产物，抑制细胞DNA合成。合成。多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗 n肿瘤化疗中面临的最大问题是肿瘤细胞的耐药肿瘤化疗中面临的最大问题是肿瘤细胞的耐药性以及造血细胞对化疗药物的敏感性，多重耐性以及造血细胞对化疗药物的敏感性，多重耐药基因（药基因（MDR）可诱导产生耐药表型。）可诱导产生耐药表型。MDR转移进入造血干细胞可以提高正常细胞对化疗转移进入造血干细胞可以提高正常细胞对化疗药物耐受，进而又可提高化疗剂量，相

31、对提高药物耐受，进而又可提高化疗剂量，相对提高了肿瘤对药物的敏感性。此外，也可以将耐药了肿瘤对药物的敏感性。此外，也可以将耐药基因的反义基因的反义RNA转入肿瘤细胞中，以抑制肿瘤转入肿瘤细胞中，以抑制肿瘤细胞对耐药基因的表达，降低了耐药性，从而细胞对耐药基因的表达，降低了耐药性，从而有助于提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。有助于提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。3细胞因子的基因治疗细胞因子的基因治疗n将细胞因子基因导入细胞，使其在局部持将细胞因子基因导入细胞，使其在局部持续分泌确定量的细胞因子。细胞因子可干续分泌确定量的细胞因子。细胞因子可干脆杀伤瘤细胞（如脆杀伤瘤细胞（如TNF），免疫调整因子）

32、，免疫调整因子（如（如IL-2）可通过调整免疫网络刺激机体）可通过调整免疫网络刺激机体免疫系统，增加免疫应答，发挥抗肿瘤作免疫系统，增加免疫应答，发挥抗肿瘤作用。目前接受的细胞因子基因有干扰素、用。目前接受的细胞因子基因有干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因白细胞介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子等相关基因，导入免疫细胞，肿瘤和非子等相关基因，导入免疫细胞，肿瘤和非肿瘤细胞中来实施人体的基因治疗。肿瘤细胞中来实施人体的基因治疗。4提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗n细胞因子的基因治疗，是提高机体抗肿瘤免疫力细胞因子的基因治疗，是提高机体抗肿瘤免疫力的较好的基因治

33、疗方案，但肿瘤细胞有的不表达的较好的基因治疗方案，但肿瘤细胞有的不表达肿瘤特异性抗原，因而不能被免疫肿瘤特异性抗原，因而不能被免疫T细胞识别，细胞识别，有的虽能表达特异性抗原，但缺少有的虽能表达特异性抗原，但缺少MHC分子表分子表达，又使达，又使T细胞难以进行限制性识别，因而细胞难以进行限制性识别，因而T细细胞不能被激活，使肿瘤细胞躲避了机体的免疫监胞不能被激活，使肿瘤细胞躲避了机体的免疫监视，有人把病毒基因或抗原基因转移到肿瘤细胞视，有人把病毒基因或抗原基因转移到肿瘤细胞中以增加肿瘤细胞的异质性，这种转基因的肿瘤中以增加肿瘤细胞的异质性，这种转基因的肿瘤细胞等于是引起肿瘤免疫应答的细胞等于是

34、引起肿瘤免疫应答的“瘤苗瘤苗”，有，有利于利于T细胞产生共刺激信号，行使对肿瘤细胞的细胞产生共刺激信号，行使对肿瘤细胞的免疫应答，增加机体抗肿瘤免疫力。免疫应答，增加机体抗肿瘤免疫力。（三）抗病毒的基因治疗（三）抗病毒的基因治疗n病毒病的基因治疗目前主要集中在治疗艾病毒病的基因治疗目前主要集中在治疗艾滋病方面，抗病毒的基因治疗策略与抗肿滋病方面，抗病毒的基因治疗策略与抗肿瘤基因治疗大致相同，主要是接受基因修瘤基因治疗大致相同，主要是接受基因修饰和基因失活的治疗策略，具体方案为：饰和基因失活的治疗策略，具体方案为：阻挡病毒复制策略、阻挡病毒复制策略、使感染使感染HIV细胞细胞死亡的方法（类似于肿

35、瘤药物自杀基因疗死亡的方法（类似于肿瘤药物自杀基因疗法）、法）、降解策略（导入促使病毒损伤的降解策略（导入促使病毒损伤的基因物质到感染细胞）。基因物质到感染细胞）。五、基因治疗的问题与前景五、基因治疗的问题与前景 n前景广袤，但问题也不少。如前景广袤，但问题也不少。如n1.伦理学问题伦理学问题n2.平安性问题平安性问题n3.技术性问题技术性问题n4.商品化问题商品化问题n5.疗效问题疗效问题目的基因的准备目的基因的准备n目的基因应是人体正常的有功能的基因，目的基因应是人体正常的有功能的基因，其表达产物已证明有活性，功能准确，在其表达产物已证明有活性，功能准确，在启动子下游可表达，信号肽必需完整

36、，有启动子下游可表达，信号肽必需完整，有标记基因可助筛选，监控重组体。标记基因可助筛选，监控重组体。受体细胞受体细胞(靶细胞靶细胞)的选择和培育的选择和培育n易取材，易培育，基因易导入，对载体敏易取材，易培育，基因易导入，对载体敏感，可培育传代，寿命相对较长，体外培感，可培育传代，寿命相对较长，体外培育能达足够量。依据疾病的性质，可选择育能达足够量。依据疾病的性质，可选择不同的细胞，如造血细胞、基质细胞、上不同的细胞，如造血细胞、基质细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞甚至肿瘤皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞甚至肿瘤细胞等均可。细胞等均可。载体的选择载体的选择1.质粒载体（穿梭载体）既具有动物（人

37、）质粒载体（穿梭载体）既具有动物（人）细胞表达元件，又具有细菌质粒相关元件。细胞表达元件，又具有细菌质粒相关元件。2.病毒载体：病毒载体：1.重组病毒载体：基因重组重组病毒载体：基因重组病毒可干脆感染细胞导入基因病毒可干脆感染细胞导入基因；3.2.重组质粒型病毒载体：在细菌中扩重组质粒型病毒载体：在细菌中扩增质粒，体外包装形成假病毒，感染靶细增质粒，体外包装形成假病毒，感染靶细胞，将基因导入。逆转录病毒和腺相关病胞，将基因导入。逆转录病毒和腺相关病毒都是比较平安有效的志向载体。毒都是比较平安有效的志向载体。DNA磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法n基因基因DNA加氯化钙再加入加氯化钙再加入Hepes

38、形成形成DNA-磷酸钙共沉淀颗粒，易被细胞吞入。此法磷酸钙共沉淀颗粒，易被细胞吞入。此法为基因转移的经典方法，常被接受。为基因转移的经典方法，常被接受。DEAE葡聚糖法葡聚糖法n基因加基因加DEAE-dextron，形成，形成DNA-DEAE葡聚糖复合物，被细胞吞入或先用葡聚糖复合物，被细胞吞入或先用DEAE处理细胞再加处理细胞再加DNA，使基因被吞入。，使基因被吞入。染色体介导法染色体介导法n收集分裂中期染色体，加磷酸钙形成共沉收集分裂中期染色体，加磷酸钙形成共沉淀物，再加入细胞以利细胞吞入。此法也淀物，再加入细胞以利细胞吞入。此法也适用于转移外源性适用于转移外源性DNA或人工合成及或人工合

39、成及PCR克隆获得的目的基因片段。克隆获得的目的基因片段。聚阳离子聚阳离子DMSO转染技术转染技术n先用先用DMSO处理细胞（变更通透性），再处理细胞（变更通透性），再加入聚阳离子（聚凝胺）处理的加入聚阳离子（聚凝胺）处理的DNA使其使其增加细胞表面吸附实力，从而使受体细胞增加细胞表面吸附实力，从而使受体细胞大大提高外源性大大提高外源性DNA的捕获量。的捕获量。细胞融合法细胞融合法 n用用PEG或仙台病毒使供或仙台病毒使供/受细胞融合以达到受细胞融合以达到基因转移至靶细胞的目的。基因转移至靶细胞的目的。脂质体介导法脂质体介导法 n脂质体包袱基因脂质体包袱基因DNA后，加入后，加入PEG预处理预

40、处理的受体细胞，使外源的受体细胞，使外源DNA-脂质体被吞入细脂质体被吞入细胞而发生基因转移。胞而发生基因转移。原生质体融合法原生质体融合法 n将带有目的基因质粒的重组菌培育制成感将带有目的基因质粒的重组菌培育制成感受态，在溶菌酶作用下，该菌形成原生质受态，在溶菌酶作用下，该菌形成原生质体，再加入原先用体，再加入原先用PEG处理的受体细胞，处理的受体细胞，发生原生质体与受体细胞融合，从而将外发生原生质体与受体细胞融合，从而将外源基因导入。源基因导入。微细胞核介导法微细胞核介导法 n供体细胞先用秋水仙素处理，再用细胞松供体细胞先用秋水仙素处理，再用细胞松弛素处理（脱核），制成微核细胞，再加弛素处

41、理（脱核），制成微核细胞，再加PEG处理的受体细胞进行细胞融合从而导处理的受体细胞进行细胞融合从而导入外源基因。入外源基因。5.基因转移的病毒载体法基因转移的病毒载体法n依据不同组织细胞和目的基因选用不同的依据不同组织细胞和目的基因选用不同的病毒载体，主要应考虑细胞对病毒的敏感病毒载体，主要应考虑细胞对病毒的敏感性等因素。性等因素。n病毒载体有一些特点病毒载体有一些特点n不同的病毒载体有不同的扩增、包装、感不同的病毒载体有不同的扩增、包装、感染、整合染、整合/游离的表达方式，如表游离的表达方式，如表13-1。特定组织细胞特定组织细胞可考虑的主要基因转移方法和途径可考虑的主要基因转移方法和途径游

42、离淋巴细胞游离淋巴细胞(exvivo)逆转录病毒载体，基因枪，电穿孔逆转录病毒载体，基因枪，电穿孔肺组织肺组织腺病毒载体，气溶胶腺病毒载体，气溶胶骨骼肌肉组织骨骼肌肉组织裸裸DNA直接注射，基因枪直接注射，基因枪脑组织脑组织单纯疱疹病毒载体单纯疱疹病毒载体动脉管壁组织动脉管壁组织逆转录病毒转染内皮细胞逆转录病毒转染内皮细胞(exvivo)通过脂质体或气囊导管回输通过脂质体或气囊导管回输肝组织肝组织逆转录病毒，直接注射逆转录病毒，直接注射(腹膜内注射，感染腹膜内注射，感染宫内动物宫内动物)或部分肝切除后门静脉内或部分肝切除后门静脉内(或肝实或肝实质内质内)注射，注射，ASORPLDNA复合物复合

43、物ASGP受体结合，基因枪受体结合，基因枪乳腺组织乳腺组织逆转录病毒载体（乳头管注射）逆转录病毒载体（乳头管注射）皮肤组织皮肤组织基因枪，电穿孔基因枪，电穿孔（1 1）动物病毒载体基因组中具有能被真核细胞识动物病毒载体基因组中具有能被真核细胞识别的有效启动子序列可以引发标记基因和外源基别的有效启动子序列可以引发标记基因和外源基因的表达；因的表达；（2 2）病毒在感染细胞中能持续地复制，使其基因病毒在感染细胞中能持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平；组拷贝数达到相当高的水平；（3 3）有些病毒具有限制自己复制的顺式（有些病毒具有限制自己复制的顺式（cis)cis)作作用元件和反式用元件和反式(trans)(trans)作用因子，经过改造后，作用因子，经过改造后，这些元件、因子能够在细胞内长期高拷贝复制，这些元件、因子能够在细胞内长期高拷贝复制，并保持外源性基因的复制型质粒特性；并保持外源性基因的复制型质粒特性；（4 4）有些病毒能高效稳定地整合到宿主细胞基因有些病毒能高效稳定地整合到宿主细胞基因组中，因此外源基因导入生效的效率较高；组中，因此外源基因导入生效的效率较高；（5 5）病毒的外壳蛋白能够识别细胞受体，高效地病毒的外壳蛋白能够识别细胞受体，高效地将外源基因导入宿主细胞。将外源基因导入宿主细胞。