实验1---大肠杆菌的培养和分离.pdf

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1、.1/8 实验 1 大肠杆菌的培养和分离 高二年级班学号：实验日期：_月日 知识准备 1背景知识：大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是微生物学和遗传学常用的实验材料，为单细胞原核生物，宽约 0.513 微米；具有由肽聚糖组成的细胞壁；周身具鞭毛，能运动。大肠杆菌是在人和动物肠道中生活的、不会致病的正常栖居菌，但若进入胆囊、膀胱等处也会引起炎症。它能利用多种糖类物质产酸、产气，其代类型为异养兼性厌氧型；其代活动能产生大肠杆菌素（抑制肠道其他分解蛋白质的微生物生长），还能合成维生素 B 和 K。它们在肠道量繁殖，几乎占粪便干重的 1/3。实验室中用于培养微生物的营养物质称为

2、培养基。按培养基的物理状态可分为：液体培养基和固体培养基。将已知的菌种引入新配制的培养基的过程称为接种。而在固体培养基表面用蘸有菌种的接种环连续划线，既可以达到接种的目的，又可以实现分离菌种的目的。这是因为划线过程中接种环与培养基表面接触，接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分细菌间的距离加大，经过培养后可出现由单个细菌细胞形成单菌落，这样就达到了分离细菌的目的。2实验原理：使用通用的细菌培养基（如 LB 液体培养基）可扩大培养大肠杆菌，使大肠杆菌迅速扩增。在 LB 固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线分离，经培养后培养基上每一个菌体会形成一个单独的菌落。这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛

3、选突变菌株的最简便方法之一。为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实验过程中要进行无菌操作。3思考题（1）为什么培养过程中会出现被其他微生物污染的现象？（2）进行了无菌操作是否肯定就不会出现被其他微生物污染的现象吗？（3）本实验的关键步骤划线分离的目的是什么？（4）在做第二次以与其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线?在操作过程中应注意什么？.2/8 实验目的 1利用液体培养基进行大肠杆菌的扩增 2用固体平面培养基进行大肠杆菌的划线分离 3了解微生物实验的操作原理和培养条件 材料用具 大肠杆菌菌种 装有固体培养基的、已灭菌培养皿；装有 LB 液体培养基的、已

4、灭菌的 250ml 三角瓶封口膜和橡皮圈 酒精灯 接种环 镊子 装有酒精棉球的广口瓶 恒温培养箱 摇床 操作流程 实验步骤 1接种前的准备 进行接种操作前，应先洗手，再用 70%的酒精棉球擦拭双手和桌面。待酒精挥发之后，再点燃酒精灯。2接种（1）接种时的要求 接种过程要在酒精灯火焰附近完成，这是因为在火焰附近形成的上升气流能避免空气中的微生物落入培养基中。接种环灭菌：将接种环在酒精灯火焰的外焰灼烧灭菌。对金属丝与柄部连接部位也要在火焰上穿梭12 次。灼烧后的接种环温度较高，为避免烫死菌种，可将其接触培养基或培养容器的壁冷却后再取菌种。（2）将固体培养基表面的大肠杆菌菌种转入液体培养基培养 右手

5、执接种环，在火焰上灭菌。用左手握住装有菌种的试管和液体培养基的三角瓶靠近酒精灯火焰，并用右手中指-无名指夹下试管口的棉塞、无名指-小指夹下三角瓶的封口膜，将试管口和三角瓶口在酒精灯的火焰上烧灼灭菌后，再将接种环伸入试管，接触培养基冷却后取菌种。将菌种转入三角瓶的液体培养基中；分别将三角瓶的封口膜和试管的棉塞复原，在封口膜上标记好接种人和接种日期。（3）将液体培养基中的大肠杆菌菌种转入固体培养基中划线分离 接种时应以左手持培养皿，在火焰旁用左手拇指、食指与中指使皿盖开启成一缝（培养皿盖不能开大，以避免杂菌落入），用灭菌过的接种环取少许菌种迅速送入培养皿，在固体培养基的表面连续平行划线 45条，将

6、培养皿转动一定角度后，用接种环通过第 1 次划线的末端部分做第 2 次连续平行划线，然后再以同样方法依次操作。（见右图）划线时接种环应与培养基表面成 30左右，注意划线要轻，不可把培养基划破，也不要使接种环碰到培养皿边缘。（见右以下图）灭菌、消毒 划线、接种 培养、观察 .3/8 3培养（1）将接有菌种和液体培养基的三角瓶在摇床上振荡培养 12h，温度控制在 37左右。（2）将划线后的固体培养基盖好，在培养皿盖上标记好接种人和接种日期，再将培养皿在 37恒温培养箱中倒置培养 1224h。倒置培养的原因是：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，并在培养皿盖子凝结成水滴，水滴如果滴落在培

7、养基表面并扩散开来，则会使不同菌落中的菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。培养 1224h 后，若在划线的末端出现不连续的单个菌落，说明菌种已被分离。实验记录 请课代表将在 37恒温培养箱中培养 1224h 的培养结果用相机拍摄下来，传给任课教师。结果分析 1.你的培养基上是否有杂种污染？如何判断？2用液体培养基与用固体培养基培养时有什么不同？原因是什么？创新空间 你对于本实验的过程和结果有何疑问？对于实验步骤有何改进建议？请将它们写在这里，我们将共同提高！实验考核 检查人：项目 实验预习 实验操作 实验安全 实验清理 实验结果 总评 成绩 其它 .4/8 预习作业 1进行接种操作前

8、，应先洗手，再用擦拭和桌面。点燃酒精灯应等待之后再进行。2倒平板和接种，都要靠近酒精灯火焰附近操作。这是因为。3接种时，接种环灭菌要特别将 在火焰上穿梭 12 次进行灭菌。灼烧后的接种环温度较高，为避免烫死菌种，可将其接触冷却后再取样和接种。4接种划线：在固体培养基的表面连续划线条，将培养皿转动一定角度后，用接种环通过第 1次划线的做第 2 次连续平行划线，然后再以同样方法依次操作。划线时要轻，不可，也不要使接种环碰到培养皿边缘。划线后盖好培养皿，将培养皿，将培养皿放入恒温培养箱中在 培养 1224h，或在室温下培养3d。实验中需将培养皿倒置的原因是：在培养皿盖子凝结成的水滴如果滴落在培养基表

9、面并扩散开来，会使很难再分成单菌落，达不到分离的目的。5 将大肠杆菌菌种由固体转入液体培养基后应将三角瓶放在上振荡培养 12h，温度控制在左右。课后作业 1以下有关实验材料大肠杆菌的表达，不正确的是 ()A属于单细胞的原核生物 B在固体培养基表面可见其细胞 C细胞壁成分与植物不同 D细胞中含有 DNA 和 RNA 2微生物实验中分别采用了高压蒸气、酒精、火焰灼烧等几种不同的灭菌处理，这些方法依次可以用于杀灭什么部位的杂菌()A接种针、手、培养基 B高压锅、手、接种环 C培养基、手、接种环 D接种针、手、高压锅 3在获得某种细菌纯净培养物的过程中，操作的关键是()A对所有器皿、培养基灭菌 B接种

10、纯种细菌 C适宜环境条件下培养 D防止外来杂菌污染 4微生物实验过程中，常需灭菌。以下灭菌操作中，错误的是()A用酒精擦拭双手 B用氯气消毒实验用水 C实验操作应在酒精灯火焰附近进行 D用酒精擦拭玻璃器皿 5有关划线接种操作的正确做法是()A接种环、培养皿等已灭菌，整个操作过程中不再灭菌 B取出菌种后需马上塞上棉塞，然后再划线 C用沾有菌种的接种环迅速划三至五条平行线即可 D最后将培养皿倒置，放入培养箱中培养 6下面是有关细菌划线分离法的表达，其中正确的是()A必须在液体培养基上操作 B划线上一定会出现单个突变菌株 C此法不能除去污染的杂菌 D划线上一定会出现细菌单菌落 7将接种后的培养基和一

11、个未接种的培养基都放入 37恒温箱的目的是()A对比观察培养基有没有被微生物利用 B对比分析培养基是否被杂菌污染 C没必要放入未接种的培养基 D为了下次接种时再使用 实验 2 分离以尿素为氮源的微生物 高二年级 班实验组编号：.5/8 实验日期：_月日 知识准备 1背景知识：脲或称尿素，是蛋白质降解的产物，人和其他哺乳动物如家畜的尿中都含有尿素。自然界中有能够分解尿素的微生物，例如：土壤中有一些细菌含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。2实验原理：（1）利用选择培养基分离得到以尿素作为唯一氮源的细菌 选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长

12、。目的是从多种微生物中分离得到所需要的微生物。在本课题提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的惟一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。（2）利用稀释涂布平板法统计菌落 用一定稀释度的样品溶液在培养基上进行涂布，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过观察菌落数可以确定样品中的细菌数量。恰当的稀释度是成功地统计菌落的关键，一般来讲，每个培养皿中有 20 个以的菌落适于计数。为保证结果的可信度，在同一稀释度下，至少要对 3 个平板进行重复计数，求出平均值。样品中细菌数量的计算方法是：平均菌落数涂布的稀释液体积稀释倍数（3）利用鉴别培养基

13、确定细菌种类：在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH 升高。因此，我们可以通过检测培养基pH 变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果 pH 升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。3思考题：（1）农作物不能直接吸收利用尿素，但尿素却是农业生产上的重要氮肥。农作物如何利用尿素中的氮？（2）怎样从杂菌中分离得到能利用尿素的细菌?（3）怎样确定单位体积稀释液中细菌的数量？（4）如何确定培养基中生长的细菌能够分解尿素？实验目的 1使用专一的培养基（含尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。2使用

14、指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。.6/8 3使用稀释平板法统计菌落数 材料用具 尿素固体培养基和 LB 固体培养基、10-2和 10-3土壤稀释液 70%酒精与酒精棉 试管架、有塞试管、广口瓶、镊子、玻璃刮刀、酒精灯、移液器、培养皿、三角瓶 操作流程 实验步骤 请在实验前预习并填写。1用镊子夹取酒精棉，将手与实验台擦拭干净，待后点燃酒精灯。2制备培养基 将两个三角瓶中已灭菌的 LB 固体培养基和尿素固体培养基，在左右时，在旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，至凝固。3制备细菌悬液 将 1g 土样加入盛有 ml 无菌水的三角瓶中，振荡 min，即成稀释液。吸取上清液 ml，

15、转移至盛有 mL 的无菌水的无菌大试管中，依此方法制备出稀释液，摇匀，放在试管架上。4.用涂布法分离细菌 取样时，尽量只取 _ 。并按照稀释液浓度由低到高的顺序分别吸取 ml 土壤稀释液加到培养基和培养基的培养皿中（不必更换移液管），再将保存在酒精中的放在上，待刮刀上火焰熄灭，在旁打开培养皿，将菌落涂布在上。5.细菌的计数 将涂布好的培养皿顶盖上写明实验容、接种人和接种日期后倒置，放在 37温度下培养 h。观察并记录菌落数。实验记录和数据处理 1有菌落的尿素培养基颜色变化是：由色变成色。2培养基中菌落数目的统计和计算：稀释度 培养基 10-2稀释度 10-3稀释度 制备培养基 制备细菌悬液 涂

16、布法分离细菌 统计菌落数 .7/8 LB 培养基菌落数 样品各种细菌的数目 尿素培养基菌落数 样品中以尿素为氮源的细菌的数目 实验结论 该样品中（含有/不含有）能分解尿素的细菌，含量约为 个/g 创新空间 你对于本实验的过程和结果有何疑问？对于实验步骤有何改进建议？请将它们写在这里，我们将共同提高！实验考核 检查人：课后练习 1以下 氮肥 能被 植物直接吸收的是()硝酸盐 尿素 磷酸二氢氨 氨 A B C D 2土壤中分解尿素的微生物所需氮源为()A硝酸 B氨 C尿素 D蛋白胨 3将某种细菌接种到彻底灭菌的固体培养基上，经过一段时间后能得到（）A无一定形态的群体 B菌丝 C单个细菌 D菌落 项

17、目 实验预习 实验操作 实验安全 实验清理 实验结果 总评 成绩 其它 .8/8 4以下表达中对尿素培养基进行灭菌的不正确操作是()A对配制好的尿素培养基进行高压蒸汽灭菌 B用置滤膜的玻璃漏斗过滤尿素溶液 C对除尿素以外的培养基成份进行高压蒸汽灭菌 D在 60时，把灭菌后的尿素溶液和其它培养基成份混合 5从土壤中分离能分解尿素的细菌，可以利用选择培养基，其成分中一定有 尿素 有机氮化合物 无机盐 有机碳化合物 水 无机的碳化合物 A B C D 6用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是()A未接种的选择培养基 B未接种的 LB 培养基 C接种了的 LB 培养基 D接种了的选择培

18、养基 7利用稀释平板法进行菌落计数时，使用的培养基种类应该是什么？为保证计数准确，形成一个菌落的最初细菌数应该是多少？（）A液体培养基、一个细菌 B液体培养基、许多细菌 C固体培养基、一个细菌 D固体培养基、许多细菌 8利用稀释平板法进行菌落计数时，培养皿中长满了大小不一的菌落，数量有 43 个，以下分析中不正确的是（）A样品稀释度不足时会出现这种情况 B接种的菌液中有 43 个细菌 C某些菌落是由多个细菌繁殖形成的 D某些菌落是由单个细菌繁殖形成的 9 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为 10-3的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()A涂布了 2 个平板，统计的菌落总数是 36，记录 36 B涂布了 2 个平板，统计的菌落数是 13 和 17，取平均值 15 C涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 2、14 和 16，取平均值 11 D涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 15、13 和 17，取平均值