茯砖茶中降胆固醇类物质的研究_王珊.docx

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1、 论文分类号： _ 飧焱 # 孩 A f SHAANXI UNIVERSITY OF SCIENCE & TECHNOLOGY 硕士学位论文 Thesis for Masters Degree 茯砖茶中降胆固醇类物质的研宄 王珊 指导教师姓名：吕嘉枥教授 学 科 名 称 . 食 品 科学 论文提交日期： 2014年 3月 论文答辩日期： 2014年 5月 学位授予单位 ： 陕西科技大学 答辩委员会主席：张敏教授 评阅人： 学校代码：丨 0708 学号： 104023 原创性声明及关于学位论文使用授权的声明 原 创 性 声 明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研宄

2、所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宄做出 重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 士轉 日期： 2014年 05月 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解陕西科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权陕西科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所

3、将本学 位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提 供信息服务。 (保密论文在解密后应遵守此规定 ） 论 文 作 者 签 名 ： 导 师 签 名 : 二綠 曰期： 2 0 1 4 年 05月 v y 淡 A # 技 大 學 申请工学硕士学位论文 论文题目： 茯砖茶中降胆固醇类物质的研究 申请学位学科：工学 所学学科专业：食品科学 培养单位：生命科学与工程学院 硕士生：王珊 导师：吕嘉枥教授 2014年 5月 A Thesis (or Dissertation) Submitted to Shaanxi University of Science and Technology i

4、n Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master of Engineering By Shan Wang Thesis Supervisor: Professor .Tia-li Lv May 2014 茯砖茶中降胆固醇类物质的研究 摘要 茯砖茶是主要生产于湖南的中国古老茶类，可制成鲜奶、奶茶或熬煮成 清茶进行食用，研究表明其具有降血脂，降低人体胆固醇水平等保健功能。 茯砖茶降血脂成分的研究主要为茶多酚，茶多糖，茶色素等，其限制了茯砖 茶功能产品的开发及推广应用。冠突散囊菌为茯砖茶中的主要优势菌种，通 过自身微生

5、物代谢影响茯砖茶的品质及风味，它是判断茯砖茶与其它茶叶不 同的重要标准之一。大量研究证明冠突散囊菌具有降血脂的作用，但目前的 相关研究主要集中于冠突散囊菌调脂的宏观效果及降脂机理等方面，不能够 反映出冠突散囊菌降脂代谢的具体化学成分。同时，其它茶叶种类黑茶，普 洱茶已被证明含有降血脂降血压生物活性作用的洛伐他汀等物质，红曲霉， 土曲霉，青霉等曲霉已被证明能够产生他汀类物质。而茯砖茶属于黑茶的一 种，冠突散囊菌属于曲霉属。 所以，本文通过 TLC、 UV、 HPLC等不同检测方法对茯砖茶及其优势 菌种冠突散囊菌中的降胆固醇类成分他汀类物质进行定性及半定量分析，其 研究结果 如下所示： 1. 以冠

6、突散囊菌的菌落生长情况为指标考察不同培养方式对冠突散囊 菌生长的影响，将其分别接种于 5%NaCl的 CZG培养基、麸皮固体培养基、 液体发酵培养基上进行菌落生长繁殖情况的观察。结果显示：不同培养基上 菌落生长形态不同。冠突散囊菌在三种培养基上生长良好，在 CZG和麸皮 固体培养基上菌丝生长较弱，易产生孢子，而在液体培养基上菌丝生长旺盛， 但产生孢子较弱。冠突散囊菌在 5%NaCl的 CZG培养基、麸皮固体培养基、 液体发酵培养基上生长的最佳时间分别为 120h、 168h、 96h。 2. 采用薄层色谱法分离茯 砖茶，冠突散囊菌中他汀类组分，和洛伐他 汀标准品，辛伐他汀标准品进行对比性研究。

7、选用 4组展开剂， 3种显色剂 对样品进行展开效果研究。结果显示：以氯仿：甲醇：水 （ 25:3:1) 为 展 开 剂，碘蒸气显色，茯砖茶分离出 7个斑点，冠突散囊菌分离出 9个斑点，其 中有 2个明显棕色斑点，标准品对照后确定为目标斑点， Rf值分别为 0.758, 0.818。因此，确定茯砖茶，冠突散囊菌中含有他汀类的可能。 3. 选用 2种标准品洛伐他汀、辛伐他汀作对照，采用紫外波长扫描对 实验收集的薄层组分中的降胆固醇类物质他汀类进行测定，结果表明：标准 品扫描结果显示他汀类物质有三个吸收峰，分别为 228nm， 238nm， 246nm， 其中 238nm为最大吸收波长，冠突散囊菌的

8、薄层组分的甲醇溶解液有 3个 相对应的吸收峰，其表明冠突散囊菌中含有目标物质。 4. 以保留时间为参考指标，采用高效液相分析了茯砖茶提取液、冠突 散囊菌固体培养物提取液、薄层斑点组分提取液、柱层析无色组分洗脱液、 冠突散囊菌液体摇床发酵提取液中的降脂目标组分，最终确定冠突散囊菌 固、液培养物的乙酸乙酯提取液中含有洛伐他汀，保留 时间分别为 4.339min、 15.209min，最高含量分别为 0.550mg/kg、 0.616mg/kg。 5. 冠突散囊菌产降胆固醇类物质洛伐他汀提取条件、高效液相色谱条 件的优化实验、液态发酵条件及洛伐他汀稳定性实验的考察。 （ 1)降胆固醇 类物质洛伐他汀

9、提取条件的优化：选用 7中提取剂，经单因素实验考查提取 剂种类，物料比，提取温度，提取时间，提取次数对冠突散囊菌中洛伐他汀 含量的影响，最终选用乙酸乙酯溶液作为提取剂，物料比 1:20,超声波 35C 下提取 20min， 提取次数 3次，洛伐他汀含量达到最大。 （ 2)高效液相色谱 法的优化条件为：建立测定洛伐他汀的高效液相色谱方法，最终确定使用 C18色谱柱，以甲醇：水（ 80:20， v/v)为流动相洗脱，流速 lmL/min， 柱 温 室 温 。 进 行 方 法 学 验 证 学 实验 ， 得 出 该 方 法 的 线 性 范 围 分 别 为 0.2-3.0lg/mL, 0.3-3.0Pg

10、/mL， 回收率、精密度、重现性分另 IJ为 99%、 1.39%、 1.32%。 （ 3)液态发酵条件的优化实验：经单因素实验对冠突散囊菌液体发 酵条件进行优化，研究了培养时间，接种量，初始发酵 pH值，滤液，菌丝 体对洛伐他汀含量的影响。结果显示：接种量 10%，初始 pH值为 5.0, 28C 培养 96h， 菌丝球数量较多，菌丝量较大，洛伐他汀主要生成于发酵初期， 菌丝体中含量大于滤液。 （ 4)降胆固醇类物质洛伐他汀稳定性的研究：以峰 面积为指标，考察不同放置时间、放置温度对洛伐他汀稳定性的影响，最终 确定其在甲醇溶液中放置 48h稳定。 关键词：茯砖茶，冠突散囊菌，洛伐他汀，定性，

11、半定量 ABSTRACT Fuzhuan brick tea is the ancient tea of nomadic people in China, the main origin is Hunan province. It is well accepted by means of making fresh milk, milk tea and boil tea. Fuzhuan brick teas lipid-lowering fiinction and adjusting digestion has been confirmed by a large number of repor

12、ts, but these reports have been mainly concerned about tea polypHenols, tea polysaccharide and tea pigment. It has limited the development and promotion of Fuzhuan brick tea fiinctional products. Eurotium cristatum is the predominant microbes in Fuzhuan brick tea, which can not only improve tea qual

13、ity and flavor, but also gives it unique health fiinctions tlirough metabolism. This is the most important character that Fuzhuan brick tea different to the others. Eurotium cristatum contributes to anti-obesity has been proved by a lots of studies, but these previous studies mainly focus on the eff

14、ect of lipid-lowering and macro-mechanism, it could not reflect the concrete chemical composition. Furthermore, the recent research have found that black tea and Aspergillus could produces statins, which has bioactivities such as reducing blood lipid, anti-thrombosis. At the same time, Fuzhuan brick

15、 tea is a special one in black tea, and also Eurotium cristatum is the kind of Aspergillus. Here, different advanced technologies such as qualitative and semi-quantitative analysis of TLC, UV, HPLC were used in the study, to analysis the lipid-lowering substances statins by Fuzhuan brick tea and Eur

16、otium cristatum. The results of this study as follows: 1. To investigate the effect of medium components on the growth characteristics of Eurotium cristatum, colony growth was chosen as direct indicator. The fiingus was respectively inoculated to three kinds of mediums (5% NaCl CZG media, wheat bran

17、 solid medium, liquid fermentation medium). The results indicated that the morpHology was different when it was cultured on different medium. The mycelia growth was relative weak and spores formed easily when grew on the CZG and wheat bran medium, whereas grew healthily and produced less spores on l

18、iquid fermentation medium. And the best growth days of Eurotium cristatum living on 5% NaCl CZG media, wheat bran solid medium and fermentation medium were 120h, 168h, 96h respectively. 2. In the work, the sample was extracted with ethyl acetate and separated by TLC plates precoated with silicagel H

19、F254 as stationary pHase. Further, lovastain and simvastain was chosen as a reference. The result show that: the extracting solution were eluted with the mobile pHase consisting of chloroform: methanol: aqueous ammonia (25:3:1), determined at UV 254 11m and stained with iodine vapor. The sample of t

20、ea could be isolated spots of 7 and the fiingus could be observed spots of 9.The two target spots show clear yellow brown and Rf value were 0.758,0.818. It proves that the sample solutions have been found the statins. 3. With lovastain and simvastatin as a reference, UV scanning method was applied t

21、o determine the statins in thin layer. The result shows that: the absorption wavelengths of statin were 228nm, 238nm, 246nm, and the maximum absorption wavelength was 23811m. I11 addition, the thin layer components of fiingus dissolved in methyl alcohol had three scan peaks. The date shows that stat

22、ins exist in the culture of Eurotium cristatum. 4. The lipid-lowering statins in fiizhuan brick tea, wheat bran solid culture, thin layer spots components, colorless eluent of column chromatograpHy and liquid fermentation broth of Eurotium cristatum were analyzed by HPLC. The results indicated that

23、the culture of fiingus contain lovastatin, and the retention time turn for 4.300min, 15.209min. Furthermore, the highest levels were 0.550mg/kg, 0.616 mg / kg. 5. The optimization of experimental conditions such as extracting condition, HPLC condition, liquid fermentation borth condition, stability

24、of lovastatin were detected in Eurotium cristatum. (1) I11 this paper, 7 solvents were used to extract lovastatin from Eurotium cristatum. And the different kinds of extracting solvent, extracting temperature, solid-liquid ratio, extracting time and extracting times were reached. It was revealed by

25、the results of single test that the optimum terms were the best solvent was ethyl acetate, extracting temperature was 35 C, solid-liquid ratio was 1:20, extracting time was 20min and extracting times was 3, under the terms mentioned above, the extraction yield could reached to maximum. (2) To establ

26、ish a HPLC method for determination of lovastain and simvastatin. The results show that: the chromatograpHic conditions were Ci8 column, methanol: water (80:20) as mobile pHase, flow rate l.OmL/min, and detected at room temperature.The linear ranges of lovastain and simvastatin were 0.2-3.0)g/mL, 0.

27、3-3.0)g/mL, respectively. The average recovery, precision, reproducibility were 99%, 1.39%, 1.32%, respectively. (3) Improving the composition of the fermentation medium in shake flasks by single factor experiments were carried out. Many conditons of lovastain fermentation were investigated includin

28、g culture time, inoculation dosage, initial pH of fermentation medium, filtrate and mycelium. The results showed that the best inoculation ratio was 10%, the best initial pH of fermentation medium was 5.0, suitable cultural temperature was 28C.And more addition of cultural time was 96h. On the other

29、 hand, lovastatin mainly produced in the initial stage. The yield of lovastatin in mycelium was greater than filtrate. (4) The stability of lovastain: Choosing the peak area as an index, lovastatin was investigated by different storage time and different storage temperature.The results show that the

30、 placement time of lovastain was 48h, and the lovastain was stable in methanol solution. KEY WORDS: Fuzhuan Brick tea, Eurotium cristatum, lovastatin, qualitative and semi-quantitative 目录 w . I ABSTRACT . Ill g i . I 1親 . 1 1.1茯砖茶研究现状 . 1 1.1.1茯砖茶概述 . 1 1.1.2茯砖茶降脂功能研究进展 . 1 1.1.3茯砖茶中有效降血脂成分 . 3 1.2茯

31、砖茶中冠突散囊菌的研究现状 . 5 1.2.1冠突散囊菌概述 . 5 1.2.2冠突散囊菌降脂功能研究进展 . 5 1.2.3冠突散囊菌中有效降血脂成分 . 6 1.3他汀类物质的研究现状 . 6 1.3.1他汀类物质概况 . 6 1.3.2他汀类物质研究进展 . 10 1.4本课题研究目的意义及内容 . 11 1.4.1研究目的及意义 . 11 1.4.2研究内容 . 11 1.4.3创新点 . 11 2实验材料与方法 . 12 2.1实验材料 . 12 2.1.1实验菌种 . 12 2.1.2主要原材料 . 12 2.1.3主要培养基组成 . 12 2.1.4主要实验试剂及药品 . 12

32、2.2主要仪器与设备 . 13 2.3试验方法 . 14 2.3.1冠突散囊菌的培养 . 14 2.3.2茯砖茶中他汀类物质的定性定量分析 . 15 2.3.3他汀类物质实验条件的优化 . 17 3结果与分析 . 20 3.1冠突散囊菌的培养 . 20 3.1.1不同培养方式对冠突散囊菌生长的影响 . 20 3.1.2 小结 . 23 3.2茯砖茶中他汀类物质的定性定量分析 . 24 3.2.1样品溶液中他汀类物质的 TLC展开分析 . 24 3.2.2样品溶液中他汀类物质的 HPLC扫描分析 . 27 3.2.3薄层组分分离检测 . 28 3.2.4柱层析分离检测 . 32 3.2.5洛伐他

33、汀、辛伐他汀标准曲线 . 33 3.2.6含量测定结果 . 34 3.2.7 小结 . 35 3.3他汀类物质实验条件的优化 . 35 3.3.1他汀类物质提取工艺的优化 . 35 3.3.2他汀类物质色谱条件的影响 . 41 3.3.3方法学验证实验 . 44 3.3.4冠突散囊菌液体发酵条件的优化 . 46 3.4稳定性研究 . 52 3.4.1 小结 . 53 4 . 54 4.1冠突散囊菌的培养 . 54 4.2茯砖茶中他汀类物质的定性定量分析 . 54 4.3他汀类物质实验条件的优化 . 54 5展望 . 55 SX if . 56 . 57 攻读学位期间发表学术论文 . 63 原创

34、性声明及关于学位论文使用授权的声明 . 64 1绪论 1.1茯砖茶研究现状 1.1.1茯砖茶概述 茯砖茶是我国六大类基本茶类中紧压黑茶的一种，是以黑毛茶或粗老绿茶为原料， 经过紧压过程而制成的再加工茶，属于后发酵茶，茯砖茶因古时须在夏季 “ 伏天 ” 生产， 因此被命名为 “ 伏茶 ” ，同时，因其入口后口感类似于中药土茯苓，又被称为 “ 茯茶 ” ， 为了便于运输和保藏，生产者将其加工成砖的样式，使其外形看似像砖片，故名 “ 茯砖 茶 ” 1-4。茯砖茶主要生产于湖南、四川、江苏、陕西、贵州、浙江等省份，主要销售于 边疆地区如新疆、甘肃、西藏等地，俗称 “ 边茶 ” 或 “ 边销茶 ” 51

35、-萘 -庚二酸 -5-内酯，结构如下图 1-1所示： 图 1-1他汀类物质结构通式 Fig. 1-1 Structure formula of statins 此结构共分为四部分 ： 1) P-羟基 -5内酯； 2)连接 5-内酯与亲脂基团部分； 3) 6氢 萘环部分； 4)侧链 酯部分，根据母核上两处支链结构的不同，可以形成多种类物质，以 下为羟酸型和内酯型的洛伐他汀结构式分别如下图 1-2、图 1-3,且羟酸型洛伐他汀在碱 性环境下可以转化为内酯型，而内酯型可以在酸性条件下转化为羟酸型，其结构转化如 图 3-4所示 图 1-2羟酸型洛伐他汀 Fig. 1-2 Hydroxy acid fo

36、rm of lovastatin 图 1-3内酯型洛伐他汀 Fig. 1-3 Lactone form of lovastain 内酯型 羟酸型 图 1-4两种结构形式之间的转变 Fig. 1-4 Transition between two forms of structure 他汀类物质的基本结构都含有羟基内酯环和萘环结构，萘环上有 Rl、 R2两个基团， 不同的他汀类物质在这两个位置上的基团不同，结构上的差别导致这些物质的理化性质 不同，对胆固醇合成的抑制能力也有所不同，其不同的结构取代如下图 1-5所示： CH 3 Lova&taim OH P/ava&talm CH 3 $ifnva

37、seiim CH | Mona Qin： | 图 1-5不同他汀类物质的基本结构 Fig. 1-5 The basic structure of the different statins substances (3) 他汀类物质合成途径的研究 洛伐他汀 57_6是一类组织选择性羟甲基戊二酰辅酶 A(HMG2C A)还原酶抑制剂 95, 其药理的研究已经成熟，是在生物合成过程中竟争性的抑制胆固醇使之减少，同时又可 以反馈调节生物细胞外表面 LDL受体的活力，达到血液中 LDL-C含量降低的目的。 在胆固醇的生物合成中 ,有一步反应为 HMG-CoA还原生成甲羟戊酸， HMG-CoA还 原酶催化

38、，此酶为胆固醇生物合成的限速酶，若抑制此酶则内源性 Ch的生成减少。下 图 1-6为胆固醇的合成途径 ： 乙酸盐一 乙酰 CoA-乙酰乙酰 CoA 3-羟 -3甲基戊二酰 CoA (HMG-CoA) HMG-CoA还原酶 j 鲨烯 - 5-磷酸甲羟戊酸内酯 - 甲羟戊酸内酯 1 羊毛甾醇 - 2,4脱氢胆固醇 - 胆固醇 图 1-6胆固醇合成途径 Fig. 1-6 Cholesterol synthesis pathway 现有的 HMG-CoA还原酶抑制剂 57_6都有类似 HMG-CoA的环状或开环结构，其中 P-羟基 -5内酯部分以游离酸形式存在的时候，与 HMG-CoA的结构接近，如下表 1-1， 环状者进入体内后必须经水解开环后才有活性， HMG-CoA还原酶被竞争抑制后，甲羟 戊酸形成受阻，使内源性 Ch不能合成。当肝细胞内 Ch浓度降低时可代偿性地使细胞膜 表面 LDL受体数量增加且活性增强，大量LDL被摄取，致使血浆