Matrix校正原理和常见问题课件.ppt

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1、光谱校正原理和常见问题光谱校正原理GoldenEye16A Matrix Standard简介简介Matrix校正校正3100常见问题及解决方案常见问题及解决方案光谱校正原理荧光和荧光物质何为Matrix？DyeSet/FilterSet评价Matrix的参数Mixture of dye-labeled PCR products from multiplex PCR reactionSample SeparationSample DetectionCCD Panel(with virtual filters)Argon ion LASER(488 nm)ColorSeparationFluor

2、escenceABI Prism spectrographCapillarySample InjectionSizeSeparationProcessing with GeneScan/Genotyper softwareSample InterpretationFigure 13.8,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2nd Edition 2005 Elsevier Academic Presshexhem SoS1S1energy(a)ExcitationEmissionWavelength(nm)ex maxem maxFluorescence(b

3、)Stokes shiftFigure 13.1,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press染料染料激激发发波波长长Excitation max.(nm)发发射波射波长长Emission max.(nm)化学名称化学名称6-FAM4955356-carboxy-fluoresceinHEX5295604,7,2,4,5,7-hexachloro-6-carboxyfluoresceinJOE5265486-carboxy-4,5-dichloro-2,7-dimethoxy-fluor

4、esceinVIC538554TAMRA(TMR)559578carboxy-tetramethylrhodamineNED553574ROX（CXR）5806056-Carboxy-X-rhodamine常用荧光物质常用荧光物质FAM(blue)HEX(green)TAMRA(yellow)ROX(red)Figure 13.3,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2nd Edition 2005 Elsevier Academic PressFigure 13.6,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2nd Editi

5、on 2005 Elsevier Academic Press染料染料filterSet何为何为Matrix？-修正不同染料发射光谱之间叠加的一个数学矩阵数学矩阵 3100的Matrix520横向：横向：20个个Bin纵向：纵向：5 dye评价Matrix的参数Q值：Pull-up峰和Pull-down峰Q值表示得到的matrix与理论值间一致性的参数。Q值为1.0表示实际matrix与理论值完全相符，无任何pulldown或pullup峰。minQ表示对pull-up或pull-down峰的容忍度。默认值为0.95。进行光谱校正后，软件会自动计算得到每根毛细管的Q值，Q值小于minQ（0.9

6、5）时，校正失败。GoldenEye16A Matrix Standard四种带有不同荧光标记的片段组成：100bp（ROX）130bp（TMR）180bp（HEX）200bp（FAM）峰高范围 不能低于750RFU 1000-4000之间最为适宜3100校正图377/310校正 GoldenEye16A Matrix Standard最小设定范最小设定范围为围为200 若红色染料引起黄色通道若红色染料引起黄色通道pull-up峰峰，应如何修，应如何修改？改？染料染料filterSetMatrix校正校正3100常见问题及解决方案常见问题及解决方案确保每个峰的峰高大于确保每个峰的峰高大于750

7、RFU。打开打开Protocol Manager，找到，找到matrix校正的校正的protocol，点击，点击Edit，在打开的对话框中，点击下方的，在打开的对话框中，点击下方的Edit Parameter；在打开的对；在打开的对话框中，将话框中，将locate start point：After scan后的数改为引物峰后后的数改为引物峰后目的峰前的目的峰前的scan number。Saturated data detected.Calibration failed.检测数据饱和，校正失败 Bad dye order detected.检测到的染料顺序错误。Failed quality check:q=0.93807 is less than minQ threshold(0.95000)