第9章-蛋白质的测定--食品检验与分析-教学课件.ppt

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1、第九章蛋白质和氨基酸的测定第九章蛋白质和氨基酸的测定1.1.概述概述2.2.凯氏定氮法凯氏定氮法3.3.蛋白质的快速测定法蛋白质的快速测定法4.4.氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定5.5.氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定1.1.蛋白质的组成蛋白质的组成蛋白质的组成蛋白质的组成 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质是是是是含含含含氮氮氮氮的的的的有有有有机机机机化化化化合合合合物物物物，分分分分子子子子量量量量很很很很大大大大。主主主主要要要要由由由由C C、HH、OO、NN、S S五五五五种种种种元元元元素素素素组组组组成成成成。某某某某些些些些蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质中中中中还还还还含含含含有有有有

2、微微微微量量量量的的的的 P P、CuCu、FeFe、II等等等等。但但但但含含含含氮氮氮氮则则则则是是是是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。在在在在食食食食品品品品和和和和生生生生物物物物材材材材料料料料中中中中常常常常包包包包括括括括蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质，可可可可能能能能还还还还包包包包括括括括有有有有非非非非蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含氮氮氮氮的的的的化化化化合合合合物物物物，（如如如如核核核核酸酸酸酸、含含含含氮氮氮氮碳碳碳碳水水水水化化化化合合合合物物物物、生生生生

3、物物物物碱碱碱碱、含含含含氮氮氮氮类类类类脂脂脂脂、卟卟卟卟啉啉啉啉和和和和含含含含氮氮氮氮的的的的色素等；色素等；色素等；色素等；）。）。）。）。第一节第一节概述概述蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分。propro是食品的重要组成是食品的重要组成之一，也是重要的营养物质，一个食品的营之一，也是重要的营养物质，一个食品的营养高低，主要看蛋白质含量的高低。养高低，主要看蛋白质含量的高低。propro除除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。香、味及结构等特征上也起着重要的作用。许多食品都要求检验其

4、蛋白质含量，蛋白质是最重要的常规检测指标，如：乳制品、肉制品中蛋白质的测定。“大头儿”事件，奶粉中几乎无蛋白质。2.食品中蛋白质含量的测定意义食品中蛋白质含量的测定意义 在在在在各各各各种种种种不不不不同同同同的的的的食食食食品品品品中中中中蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的含含含含量量量量各各各各不不不不相相相相同同同同，一一一一般般般般说说说说来来来来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如例如例如例如：牛肉中蛋白质含量为牛肉中蛋白质含量为牛肉中蛋白质含量为牛肉中蛋白质含量为2

5、0.0%20.0%左右，左右，左右，左右，猪肉中为猪肉中为猪肉中为猪肉中为9.5%9.5%，兔肉为兔肉为兔肉为兔肉为21%21%，鸡肉为鸡肉为鸡肉为鸡肉为20%20%，牛牛牛牛乳乳乳乳为为为为3.5%3.5%黄黄黄黄鱼鱼鱼鱼为为为为17.0%17.0%，带带带带鱼鱼鱼鱼为为为为18.0%18.0%，大大大大豆豆豆豆为为为为40%40%，稻稻稻稻米米米米 为为为为8.5%8.5%，面面面面粉粉粉粉为为为为9.9%9.9%，菠菠菠菠菜菜菜菜为为为为2.4%2.4%，黄黄黄黄瓜瓜瓜瓜为为为为1.0%1.0%，桃桃桃桃为为为为0.8%0.8%，柑柑柑柑橘橘橘橘为为为为0.9%0.9%，苹苹苹苹果果果果

6、为为为为0.4%0.4%和油菜为和油菜为和油菜为和油菜为1.5%1.5%左右。左右。左右。左右。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋一般蛋一般蛋一般蛋白质含氮量为白质含氮量为白质含氮量为白质含氮量为16%16%，即一，即一，即一，即一 份氮素相当于份氮素相当于份氮素相当于份氮素相当于6.256.25份蛋白质，此数值（份蛋白质，此数值

7、（份蛋白质，此数值（份蛋白质，此数值（6.256.25）称为蛋白质系数）称为蛋白质系数）称为蛋白质系数）称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为为6.25，花生为，花生为5.46，大米为，大米为5.95，大豆及其制品为，大豆及其制品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为，牛乳及其制品为6.38。3.蛋白质数系蛋白质数系4.蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法分两大类：蛋白质的测定方法分两大类：蛋白质的测定方法分两大类：蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含

8、氮量、肽键和折一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；射率等测定蛋白质含量；射率等测定蛋白质含量；射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法：具体测定方法：具体测定方法：具体测定方法：凯氏定氮法

9、凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法GBGB经典法。最常用的，国内外应用普遍。经典法。最常用的，国内外应用普遍。经典法。最常用的，国内外应用普遍。经典法。最常用的，国内外应用普遍。双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应 酚试剂法酚试剂法酚试剂法酚试剂法 紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法快速测定法快速测定法快速测定法快速测定法 染料结合反应染料结合反应染料结合反应染料结合反应 考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250法法法法 国外：国外：国外：国外：红外分析仪红外分析仪红外分析仪红外分析仪第二节凯氏定氮法方法特点：1.测定样品中的总含氮量，再乘以相应的蛋白质换

10、算测定样品中的总含氮量，再乘以相应的蛋白质换算系数，而求出蛋白质含量。不同食品的蛋白质系数有所不系数，而求出蛋白质含量。不同食品的蛋白质系数有所不同。同。2.2.凯氏定氮法凯氏定氮法是是测定总有机氮量较为准确测定总有机氮量较为准确、操作较为操作较为简单的方法之一，简单的方法之一，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析经典分析方法，至今仍方法，至今仍 被作为标准检验方法。被作为标准检验方法。适用范围：适用范围：适用范围：适用范围：此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。此法可应用于各类食品中蛋白质含

11、量测定。此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。凯氏定氮法分：常量微量自动蛋白质分析仪三种，它们的测定原理相同。原理原理样样品品与与浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化，使使蛋蛋白白质质分分解解，其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出，而而样样品品中中的的有有机机氮氮转转化化为为氨氨与硫酸结合成硫酸铵。与硫酸结合成硫酸铵。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高，加入硫酸钾

12、之后可以提高至至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。高沸点，但效果不如硫酸钾。加硫酸铜加硫酸铜加硫酸铜加硫酸铜作为催化剂作为催化剂作为催化剂作为催化剂。还可以作消化终点指。还可以作消化终点指。还可以作消化终点指。还可以作消化终点指示剂（消化终点不再有硫酸亚铜生成，溶液呈现示剂（消化终点不再有硫酸亚铜生成，溶液呈现示剂（消化终点不再有硫酸亚铜生成，溶液呈现示剂（消化终点不再有硫酸亚铜生成，溶液呈现清澈的蓝绿色）。（做蒸馏时碱性指示剂）。清澈的蓝绿色）。（做蒸馏时碱性指示剂）。清澈的蓝绿色）。（做蒸馏时碱性指示剂）。清澈的蓝绿色）。（做蒸

13、馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。二氧化钛。二氧化钛。二氧化钛。加氧化剂加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速如双氧水、次氯酸钾等加速有机有机物氧化速度。物氧化速度。常量蒸馏终点的判断：常量蒸馏终点的判断：常量蒸馏终点的判断：常量蒸馏终点的判断：NH3NH3的检查的检查的检查的检查：以奈氏试剂检查。：以奈氏试剂检查。：以奈氏试剂检查。：以奈氏试剂检查。奈氏试剂的配制奈氏试剂的配制奈氏试剂的配制奈氏试剂的配制：P220P220 微量蒸

14、馏的终点：蒸馏微量蒸馏的终点：蒸馏微量蒸馏的终点：蒸馏微量蒸馏的终点：蒸馏10min10min常常常常量量量量蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏结结结结束束束束必必必必须须须须检检检检查查查查NH3NH3是是是是否否否否蒸蒸蒸蒸完完完完全全全全，微微微微量量量量蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏以时间判断终点，因它的以时间判断终点，因它的以时间判断终点，因它的以时间判断终点，因它的NH3NH3含量少。含量少。含量少。含量少。操作方法：整个过程分三步：整个过程分三步：消化消化蒸馏蒸馏吸收与滴定吸收与滴定样品消化2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（一定要用

15、浓硫酸（98%）消化装置：P219P219原始的装置原始的装置vv自动回流消化装置自动回流消化装置vv红外线消煮炉红外线消煮炉仪器：仪器：219页页 要防止爆沸。要防止爆沸。蒸馏：蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：2N2Na aOHOH (NH(NH4 4)2 2SOSO4

16、4 2NH2NH3 3 NaNa2 2SOSO4 4 2H2H2 2O O蒸馏装置：常量与微量凯氏定氮法有所不同。常量凯氏定氮法：常量凯氏定氮法：常量凯氏定氮法：常量凯氏定氮法：直接加热蒸馏直接加热蒸馏直接加热蒸馏直接加热蒸馏消化液消化液消化液消化液+40%+40%氢氧化钠加热蒸氢氧化钠加热蒸氢氧化钠加热蒸氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。馏，放出氨气。馏，放出氨气。馏，放出氨气。微量凯氏定氮法：水蒸汽蒸馏见实验动画注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：（1 1）所用试剂应用所用试剂应用无氨蒸馏水无氨蒸馏水无氨蒸馏水无氨蒸馏水配制。配制。（2 2）消化过程应注意消化过程应注意转动转动转动转动 凯氏

17、烧瓶，凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下下消化完全。消化完全。（3 3）若样品含脂肪或糖较多时，应注意若样品含脂肪或糖较多时，应注意发发生生的大量的大量的的泡沬泡沬泡沬泡沬可加入可加入 少量辛醇或液体石蜡，或硅少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度源强度。（4 4）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入瓶冷却，加入300300g/Lg/L2323mlml过氧化氢过氧化氢过氧化氢过氧化氢后再加后再加热。热。一般消化至透明后，继续消化一般

18、消化至透明后，继续消化30min即可即可，但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。（8）蒸馏过程应注意接头处无松松漏漏 现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。（9）硼硼酸酸吸吸收收液液的的温温度度不应超过40C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。（1010）混混合合指指示示剂剂在在碱碱性性溶溶

19、液液中中呈呈绿绿色色 ，在在中中性性溶溶液液中中呈呈 灰灰色色 ，在在酸酸性性溶溶液中呈液中呈 红色红色 。K氏自动定氮仪：氏自动定氮仪：其装置内具有自动其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置动吸收和滴定装置以及自动数字显示以及自动数字显示装置，消化装置：装置，消化装置：由优质玻璃制成的由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。外线装置的消化炉。北京福德泰和科技有限公司北京福德泰和科技有限公司产品名称：产品名称：凯氏定氮仪凯氏定氮仪第三节蛋白质的快速测定法蛋白质快速测定法：包括：双缩脲法福林酚比色法紫外分光光度法考马斯亮蓝染料比色法双缩脲法原理原

20、理当当脲脲（尿尿素素）NH2CONH2被被小小心心地地加加热热至至150160时时，两两分分子子缩缩和和成成双双缩脲。缩脲。NH2CONH2+NH2CONH2NH2CONHCONH2 +NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合紫色络合物物，这种反应叫，这种反应叫双缩脲反应双缩脲反应。（缩二脲反应）。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键蛋白质分子中含有肽键CONH与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质其颜色深浅与蛋白质含量成正比含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，

21、可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（确定含量。（560nm）方法特点及应用范围方法特点及应用范围本法本法灵敏度较低灵敏度较低，但，但操作简单快速操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。等作物种子及肉类等样品测定。另外，采用此法测定蛋白质样品不用另外，采用此法测定蛋白质样品不用消化。比色所用标准蛋白质采用凯氏定氮消化。比色所用标准蛋白质采用凯氏定氮法测出的样品。法测出的样品。二、紫外吸收法二、紫外吸收法原理原理利用蛋白质的特有基团，利用蛋白质的特有

22、基团，R R（NHCH NHCHCOCO）在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用。在波长（用。在波长（280mm）下，光吸收程度与蛋白）下，光吸收程度与蛋白质浓度（质浓度（3mgmL）成直线关系，因此，）成直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯事先用凯氏定氮法测定蛋白质含量的标准样所作的标准曲氏定氮法测定蛋白质含量的标准样所作的标准曲线线，即可求出样品蛋白质含量。，即可求出样品蛋白质含量。适用范围：适用范围：本法操作简便迅速，常用于生物化学本法操作简便迅速，常用于生物化学研究工作；但由于许多非蛋白质成

23、分在紫研究工作；但由于许多非蛋白质成分在紫外光区也有吸收作用，干扰因素，故在食外光区也有吸收作用，干扰因素，故在食品分析领域中的应用并不广泛。品分析领域中的应用并不广泛。最早用于测定牛乳的蛋白质含量，也最早用于测定牛乳的蛋白质含量，也可用于测定小麦面粉、糕点、豆类、蛋黄可用于测定小麦面粉、糕点、豆类、蛋黄及肉制品中的蛋白质含量。及肉制品中的蛋白质含量。用凯氏法测定作标样做标准曲线用凯氏法测定作标样做标准曲线三、福林三、福林三、福林三、福林-酚比色法酚比色法酚比色法酚比色法1 1原理原理原理原理蛋白质与福林（蛋白质与福林（蛋白质与福林（蛋白质与福林（FolinFolin）-酚试剂反应，产生蓝酚试

24、剂反应，产生蓝酚试剂反应，产生蓝酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的铜盐产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的铜盐产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的铜盐产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸酪氨酸与色氨酸同磷钼酸酪氨酸与色氨酸同磷钼酸酪氨酸与色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜磷钨酸试剂反应产生颜磷钨酸试剂反应产生颜磷钨酸试剂反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量成正

25、比，是检测可溶性色。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性色。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性色。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。2 2说明说明说明说明福林福林福林福林-酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小22个数量级。但对双缩脲法有干扰的物质对福林酚个数量级。但对双缩脲法有干扰的物质对福林酚个数量级。但对双缩脲法有干扰的物质对福林酚个数量级。

26、但对双缩脲法有干扰的物质对福林酚法的影响更大。酚类及柠檬酸均对本法有干扰。法的影响更大。酚类及柠檬酸均对本法有干扰。法的影响更大。酚类及柠檬酸均对本法有干扰。法的影响更大。酚类及柠檬酸均对本法有干扰。本法在本法在本法在本法在0 060mg/L60mg/L蛋白质范围呈良好线性关蛋白质范围呈良好线性关蛋白质范围呈良好线性关蛋白质范围呈良好线性关系。系。系。系。四、考马斯亮蓝四、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量1.1.原理原理考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250是一种蛋白质染料，考马斯亮是一种蛋白质染料，考马斯亮蓝蓝G-250G-250在游离状态下呈在游离状态下呈红色，当它红色

27、，当它红色，当它红色，当它与蛋白质结合后与蛋白质结合后与蛋白质结合后与蛋白质结合后变为变为变为变为青色青色青色青色，使蛋白质染色，在，使蛋白质染色，在，使蛋白质染色，在，使蛋白质染色，在620nm620nm处有最大吸收处有最大吸收处有最大吸收处有最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。值，可用于蛋白质的定量测定。值，可用于蛋白质的定量测定。值，可用于蛋白质的定量测定。此法简单而快速，适合大量样品的测定，灵敏度与此法简单而快速，适合大量样品的测定，灵敏度与福林酚法相似，但不受酚类、游离氨基酸和小分子的福林酚法相似，但不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。影响。该法是该法是19761976年年Bradf

28、ordBradford建立，试剂配制简单，操作建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为测定蛋白质浓度范围为0 01000g1000gmLmL，是一种常用，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。的微量蛋白质快速测定方法。2.2.说明说明：（1 1）BradfordBradford法由于染色方法简单迅速，干扰法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。的测定。（2 2）有些阳离子，如）有些阳离子，如K+K+、Na+Na+、Mg

29、2+Mg2+、(NH4)2SO4(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如去污剂如TritonX-100TritonX-100、SDSSDS等严重干扰测定。等严重干扰测定。（3 3）蛋白质与考马斯亮蓝）蛋白质与考马斯亮蓝G-250G-250结合的反应十结合的反应十分迅速，在分迅速，在2min2min左右反应达到平衡；其结合物在左右反应达到平衡；其结合物在室温下室温下1h1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。长时间，否则将使测定结果偏低。双指示剂甲醛滴定法：双指示剂甲醛滴定法：电位滴定

30、法：茚三酮比色法：茚三酮比色法：第四节氨基酸总量的测定一、双指示剂甲醛滴定法一、双指示剂甲醛滴定法1.1.原理：原理：氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH-COOH基和碱性的基和碱性的基和碱性的基和碱性的-NH2-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，当加入甲醛溶液时，当加入甲醛溶液时，当加入甲醛溶液时，-NH2-NH2基与甲醛结合，从而基与甲醛结合，从而基与甲醛结合，从而基与甲醛结合，从而使其碱性消失。

31、这样就可以用标准强碱溶液来滴使其碱性消失。这样就可以用标准强碱溶液来滴使其碱性消失。这样就可以用标准强碱溶液来滴使其碱性消失。这样就可以用标准强碱溶液来滴定定定定-COOH-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。基，并用间接的方法测定氨基酸总量。基，并用间接的方法测定氨基酸总量。基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如：反应式（有三种不同的推论）如：反应式（有三种不同的推论）如：反应式（有三种不同的推论）如：2 2方法特点及应用方法特点及应用方法特点及应用方法特点及应用此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容此法简单易行、快速方便，

32、与亚硝酸氮气容此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。量法分析结果相近。量法分析结果相近。量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。利用情况，并以此

33、作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；结果偏低；结果偏低；结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；致使结果偏高；致使结果偏高；致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往

34、使结果偏高。果偏高。果偏高。果偏高。3 3 3 3试剂：试剂：试剂：试剂：40%40%40%40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将氢氧化钠将氢氧化钠将氢氧化钠将40%40%40%40%甲醛中和至蓝色。甲醛中和至蓝色。甲醛中和至蓝色。甲醛中和至蓝色。0.1%0.1%0.1%0.1%百里酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液，0.1%0.1%0.1%0.1%中性红中性红中性红中性红50%50%50%50%乙醇溶液，乙醇溶液，乙醇溶液，乙醇溶液，0.

35、1 mol/L 0.1 mol/L 0.1 mol/L 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。4 4操作：同时取两份样：操作：同时取两份样：+中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和 样液中其它酸性物质。样液中其它酸性物质。样液中其它酸性物质。样液中其它酸性物质。+百里酚酞百里酚酞百里酚酞百里酚酞+中性甲醛中性甲醛中性甲醛中性甲醛+NaOH+NaOH+NaOH+NaOH 滴定，中和了滴定，中和了滴定，中和了滴定，中和了 样液中氨基酸的羧基

36、与其它酸性物质的总样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总 和。和。和。和。二者之差可计算氨基酸含量二者之差可计算氨基酸含量二者之差可计算氨基酸含量二者之差可计算氨基酸含量5 5说明及注意事项说明及注意事项（1 1 1 1）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。（2 2 2 2）若若若若样样样样品品品品颜颜颜颜色色色色较较较较深深深深，可可可可加加加加适适适适量量量量活活活活性性性性炭炭炭炭脱脱脱脱色色色色后后后后再再再再测

37、测测测定。定。定。定。(3)(3)(3)(3)氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出直接测定出直接测定出直接测定出1717种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基

38、酸同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们量，它们量，它们量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示，当然，当然，当然，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，如果食品中只含有一种

39、氨基酸，如味精中的谷氨酸，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。百里酚酞百里酚酞PH9.2PH9.2中性红中性红PH7.0PH7.0中点中点二、茚三酮比色法-测蘑茹中氨基酸含量测蘑茹中氨基酸含量(水浴温度水浴温度98980.30.3)1原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物(除脯氨酸外均有此反应)，可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。说明说明及注意事

40、项：及注意事项：P237P237通常采用的样品处理方法为：通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样准确称取粉碎样品品5 510g10g或吸取样液样品或吸取样液样品5 510mL10mL，置于烧杯中，加入置于烧杯中，加入50mL50mL蒸馏水和蒸馏水和5g5g左右活性炭，左右活性炭，加热煮沸，过滤，用加热煮沸，过滤，用303040mL40mL热水洗涤活性炭，热水洗涤活性炭，收集滤液于收集滤液于100mL100mL容量瓶中，加水至标线，摇匀容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。备测。茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈氧化呈淡红色或深红色淡红色或深红色，

41、使用前须进行纯化，使用前须进行纯化，具，具体操作可参阅黄伟坤等编著食品检验与分析。体操作可参阅黄伟坤等编著食品检验与分析。思考题：1 1 1 1.简简简简述述述述凯氏定氮法测定凯氏定氮法测定凯氏定氮法测定凯氏定氮法测定蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质的原理的原理的原理的原理 2.2.2.2.硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？3.3.3.3.某某某某分分分分析析析析检检检检验验验验员员员员称称称称取取取取面面面面粉粉粉粉1.000g1.000g1.000g1.000g于于于于100ml100ml

42、100ml100ml凯凯凯凯氏氏氏氏烧烧烧烧瓶瓶瓶瓶中中中中。将将将将消消消消化化化化液液液液冷冷冷冷却却却却后后后后，转转转转入入入入100ml100ml100ml100ml容容容容量量量量瓶瓶瓶瓶中中中中定定定定容容容容，移移移移取取取取消消消消化化化化稀稀稀稀释释释释液液液液10ml10ml10ml10ml于于于于微微微微量量量量凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏装装装装置置置置的的的的反反反反应应应应管管管管中中中中，用用用用水水水水蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏，2%2%2%2%硼硼硼硼酸酸酸酸吸吸吸吸收收收收后后后后，馏馏馏馏出出出出液液液液用用用用0.0998mo

43、l/L0.0998mol/L0.0998mol/L0.0998mol/L盐盐盐盐酸酸酸酸滴滴滴滴定定定定至至至至终终终终点点点点，消消消消耗耗耗耗盐盐盐盐酸酸酸酸5.12ml5.12ml5.12ml5.12ml。空空空空白白白白对对对对照照照照消消消消耗耗耗耗盐盐盐盐酸酸酸酸标标标标准准准准液液液液0.10ml0.10ml0.10ml0.10ml，计计计计算算算算该该该该面面面面粉粉粉粉中中中中粗粗粗粗蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的含含含含量量量量。（面面面面粉粉粉粉的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质系系系系数数数数为为为为5.705.705.705.70）4 4 4 4.名词解释：粗纤维、膳食纤维素。名词解释：粗纤维、膳食纤维素。名词解释：粗纤维、膳食纤维素。名词解释：粗纤维、膳食纤维素。