实时PCR技术检测空肠弯曲菌的开发与应用.doc

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1、实时PCR技术检测空肠弯曲菌的开发与应用摘要目的：建立实时聚合酶链反应（PCR）方法来检测和量化粪便中的空肠弯曲杆菌。方法：将引物和探针的实时PCR检测基于空肠弯曲杆菌的HIPO基因的特定的DNA序列上。探针与硝化细菌属和其他肠道病原体的特异性想拮抗。对最优的PCR反应条件进行了测试，一组确定用一个标准的空肠弯曲杆菌作为模板条件。该检出限是从所得细菌培养中使用纯化的DNA，并从粪便中提取DNA标本。242个标本用于用实时PCR技术检测空肠弯曲菌的分析。结果：最佳的PCR反应体系确定使用参照DNA模板，1尿嘧啶DNA糖基化酶，3.5 mmol / L的氯化镁 ，1.25铂的Taq聚合酶，0.4

2、mmol / L的PCR扩增核苷酸混合物，0.48mol/ L的每种引物，0.2mol/ L的探针和2微升DNA的模板，最终体积为25微升。 PCR反应进行如下：954 min，然后10秒95，30秒59循环45个。检测极限为从细菌培养中纯化的DNA为4.3 CFU / mL，从粪便标本中提取的DNA为1000CFU / g。从细菌培养分离出二十（8.3，242分之20）空肠弯曲菌菌株，而用实时PCR发现41（16.9， 二百四十二分之四十一）个样本。 PCR产物的DNA测序表明空肠弯曲杆菌在样品中的存在。一个空肠弯曲菌和沙门氏菌混合感染的检测在一个标本和PCR测试对于这个标本是积极的。结论：

3、从粪便标本中检测空肠弯曲菌用PCR法比用直接培养法的敏感性要高。关键词：空肠弯曲菌;实时聚合酶链式反应;应用引言全世界人类细菌性胃肠炎主要原因是弯曲杆菌，沙门氏菌属，耶尔森菌属，志贺氏菌，大肠杆菌(大肠埃希氏菌O157)。弯曲杆菌、空肠弯曲菌（空肠弯曲杆菌）是影响人类弯曲杆菌的主要物种。因为对弯曲杆菌感染进行了调查，随后在中国20世纪80年代初有相当大的研究兴趣，已经有不少在腹泻患者中检测室空肠弯曲杆菌感染的报告。然而，20世纪90年代空肠弯曲菌腹泻患者放入报告后期以来已减少。改善卫生条件可以解释这种数量的下降，然而，在检测到这种病原菌难度可能是另一个报告和隔离的频率数量减少。我们最近的试验研

4、究表明，这种病原体的分离，腹泻患者粪便标本的比例为监测点在不同实验室之间的显着不同（2-15未发表）。灵敏，准确的检测这种病菌是很重要的，无论是对患者的治疗和流行病学研究分析，随着基因组DNA测序，在线数据库和生物信息学分析，核酸方法，特别是聚合酶链式反应的发展（PCR）的方法，已成为有前途的工具，用于快速，可靠，灵敏地检测和诊断病原感染。在这项研究中，我们开发了一个实时PCR法检测空肠弯曲杆菌，然后，我们比较从腹泻患者获得粪便标本用PCR分析DNA序列和直接培养法检测空肠弯曲菌。在这项研究中获得的结果证明患者腹泻用于PCR检测空肠弯曲杆菌感染，可能会导致空肠弯曲菌的分离预筛选方法的发展。材料

5、与方法样品采集和基于细菌培养技术的检测242个粪便从十一家医院腹泻患者ED（年龄介于6至72岁）收集。该标本转移至实验室细菌培养4小时。该样品的其余部分在-80 冻结，进行DNA提取。无菌棉签在每次大便样本中挑染，选择性Skirrow琼脂平板组成的哥伦比亚琼脂基础（ CM331,Oxoid公司，英国Basingstoke）,选择性补充（ SR0069 ，Oxoid公司）,和5去纤维羊血。将板温育在微需氧环境中（5氧气，10 二氧化碳和85 氮气） ，在42 培养48小时。挑取可疑菌落，并通过革兰氏染色鉴定，根据我们以前的报告，用氧化酶和过氧化氢酶试验和马尿酸盐水解分析。所有标本均同时检查是否存

6、在志贺菌属，沙门氏杆菌，耶尔森菌属和大肠杆菌O157，分别通过细菌上的木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂，脱氧硫化氢乳糖琼脂，头孢磺啶- 氯苯酚 - 新生霉素琼脂和山梨醇麦康凯琼脂。可疑菌落用API 20E条进行生化鉴定，并将培养物通过进一步的血清型或PCR分析证实。细菌培养DNA的制备参照基因组DNA从在这项研究中的空肠弯曲分离物通过使用QIAamp DNA迷你试剂（Qiagen，杜塞尔多夫，德国）培养提取。脱氧核糖核酸从其他病原体的参考模板，李怀奇京和彪侃参考的DNA模板如表1所示。引物和探针设计该hipO基因的特定DNA片段使用BLASTN和Vector NTI 6.0软件进行了比较。由上海辉瑞生物

7、技术有限公司设计并合成引物和探针组。在这项研究中使用的引物和探针的序列分别为：hipO-F,5-CGGATAGTTATAGTATTGAAGT-TATTGG-3, hipO-R,5-GAAGCAGCATAAATAG-GATCTTTTG-3,hipO-P,5-FAM-TTCTGGAG-CACTTCCATGACCACC-BHQ1-3。实时PCR的优化最佳的PCR条件通过测试一系列的标准空肠弯曲菌模板决定的。标准的PCR曲线利用空肠弯曲菌菌株NCTC11168基因组DNA构建。此法从纯培养和粪便标本，检出限参考量化的空肠弯曲菌的基因组DNA模板，10倍稀释液（11001106CFU/mL）和将相同数量细菌接种到先前证实不含弯曲杆菌粪便标本上。使用来自其他肠道病原体的基因组DNA对特异性进行了验证。空肠弯曲杆菌接种的样品对检测限也进行比较。重复性评价为了评估该实验的可重复性，两个独立的空肠弯曲菌的基因组DNA模板均采用每个浓度稀释重复三次（NCTC11168和ATCC33560）。还对三个不同的空肠弯曲杆菌菌株（81116，ATCC49349和ICDCCJ07001）同时连续稀释。在皮克/毫升的基因组DNA和阈值循环（Ct）的基础上构造出曲线。使用Ct值的SD和各稀释曲线的斜率的SD，分别对重现性进行了评估。