Tan第二章-基因工程的工具酶PPT课件.ppt

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1、在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确本课程内容本课程内容第一章第一章 绪论绪论第二章第二章 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶第三章第三章 基因工程的载体基因工程的载体第四章第四章 目的基因的制备目的基因的制备第五章第五章 目的基因导入和重组子的筛选目的基因导入和重组子的筛选第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达第七章第七章 基因操作的基本技术基因操作的基本技术第八章第八章 植物基因工程及应用植物基因工程及应用第九章第九章 动物基因工程及应用动物基因工程及应用第十章第十章 医学基因工程及应用医学基因工程及应用.3/21/

2、20231欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确第二章第二章 基因工程的工具酶基因工程的工具酶2.1 核酸酶核酸酶2.2 甲基化酶甲基化酶2.3 连接酶连接酶2.4 聚合酶聚合酶2.5 修饰酶修饰酶.3/21/20232欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1 核酸酶核酸酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2.1.1 限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法

3、2.1.3 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列2.1.4 限制性内切酶的切割位点限制性内切酶的切割位点2.1.5 限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系限制性核酸内切酶的反应体系2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性限制性核酸内切酶的星活性2.1.8 限制性核酸内切酶对限制性核酸内切酶对DNA的消化作用的消化作用2.1.9 限制性核酸内切酶酶切注意事项限制性核酸内切酶酶切注意事项.3/21/20233欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确几乎所有的生物都能合

4、成自身所需要的酶，包几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。括许多病毒。酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。改变而改变。Ribozyme：具有催化能力的具有催化能力的RNA。酶不都是蛋酶不都是蛋白质。白质。定义：定义：由活细胞产生，能在体外和体内起同样由活细胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括包括蛋白质和核酸蛋白质和核酸等。等。.3/21/20234欢迎同学们听课！在整

5、堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确限制性内切酶（Endonucleosase）的发现 50年代初发现细菌能将外来年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制限制修饰修饰，它们由三个基因位点所控制：，它们由三个基因位点所控制：hsd R,hsd M,hsd S,十年后，人们搞清了细菌的限制与修

6、十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理：饰分子机理：hsd R-限制性内切酶限制性内切酶 hsd M-限制性甲基化酶限制性甲基化酶 hsd S-控制两个系统的表达控制两个系统的表达.3/21/20235欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确19681968年年SmithSmith等人从流感嗜血杆菌株中分离等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，出两个类内切酶，Hind II和和Hind III，为，为基因工程技术的诞生奠定了基础。基因工程技术的诞生奠定了基础。截止到目前为止，已经分离出截止到目前为止，已

7、经分离出400400余种余种IIII类类酶酶，搞清识别位点的有，搞清识别位点的有300300种，商品化的约种，商品化的约有有100100种，而实验室常用的有种，而实验室常用的有2020种种 。.3/21/20236欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确.3/21/20237欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确.3/21/20238欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，

8、由浅入深，所提出的问题也很明确IIIIII类：类：识别位点严格专一（不是回文序列），识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。但切点不专一，往往不在识别位点内部。2个亚基组成：个亚基组成：Hsd M甲基化 Hsd R限制性内切酶功能需要需要ATP、Mg2+，类似于，类似于 I 应用同样受限制。应用同样受限制。.3/21/20239欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确IIII类：类：识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。识别位点内

9、将双链切断。因此在基因工程中具因此在基因工程中具有实用价值的是有实用价值的是IIII类限制性内切酶类限制性内切酶。应用最广，酶最简单应用最广，酶最简单(Mg2+)，不需要特殊条件，不需要特殊条件 具有两个亚基：具有两个亚基：Hsd M甲基化 Hsd R限制性内切酶功能 切割特异切割特异.3/21/202310欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法用用属属名名第第一一个个字字母母和和种种名名的的头头两两个个字字母母组组成成的的3个个字字母母斜斜体体的的

10、略略语语表表示示寄寄主主菌菌的的物物种种名名以以及及菌菌株株（型型）的的代代号号命命名名。该该菌菌株株（种种）中中发发现现的的不不同同的的酶酶按按照照顺顺序序以以罗罗马马字字母母编编号号I,II,III等等。如如：Escherichia coli 用用Eco表表示示。第第四四个个字字母母代代表表菌菌株株或或株株型型、变变种种名名，若若酶酶存存在在于于质质粒粒上上，则则需需大大写写字字母母表表示示非非染染色色体体遗遗传传因因子子。例例：Hind III 从从流流感感嗜嗜血血菌菌株株（Haemophilus Influenzue）d 株株中中分分离离的的第第三三个个酶酶。EcoR I 表表示示基基

11、因因位位于于Escherichia coli中的抗药性中的抗药性R质粒上。质粒上。.3/21/202311欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确derivation：first three names from the latin names of the microorganism that produces them.first letter(genus),next two letters(species)writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。前三个字母用斜体，其他用正体表示。如果酶存在于一种

12、特殊菌株中，三个字母后加上菌如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号株名称符号,名称最后部分往往包含罗马数字名称最后部分往往包含罗马数字,表表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。.3/21/202312欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.3 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列识别序列识别序列 指指限限制制性性内内切切酶酶在在双双链链DNA上上能能够够识识别别的的特特殊殊核苷酸序列核苷酸序列专一专一通常通常46个特定的核苷酸对组成个特定的

13、核苷酸对组成迴迴文文结结构构(palindromic sequence)或或旋旋转转对对称称或或二二重重互互补对称补对称.3/21/202313欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确recognition sequence:cleave DNA symmetrically in both strands at short palindromic(symmetrical)recognition sequences to leave a 5-phosphate and a 3-OH.They leave blun

14、t ends,or protruding 5-or 3-termini.EcoR:*5G A A T T C 3 3C T T A A G 5 *.3/21/202314欢迎同学们听课！recognition sequencerecognition sequence enzymes enzymes 5 5 GTT AAC 3 GTT AAC 3 HpaHpa blunt end blunt end 3 3 CAA CAATTG 5TTG 5 5 5 G GAATTC 3AATTC 3 EcoEcoR 5protruding endR 5protruding end 3 3 CTTAA CTTA

15、AG 5G 5 5 5 A AAGCTT 3AGCTT 3 HinHind 5protruding end d 5protruding end 3 3 TTCGA TTCGAA 5A 5 5 5 G GGATCC 3GATCC 3 Bam BamH 5protruding endH 5protruding end 3 3 CCTAG CCTAGG 5G 5 5 5 CTGCA CTGCAG 3G 3 PstPst 3protruding end 3protruding end 3 3 G GACGTC 5ACGTC 5 .3/21/202315欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生

16、带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确识别序列在识别序列在DNA上出现的概率上出现的概率 1/4n（n识别序列核苷酸组成的数目）识别序列核苷酸组成的数目）SauSau3A3A 4 碱基酶碱基酶,则每隔则每隔256(44)bp会出现一个识别位点。会出现一个识别位点。EcoR I、Pst I 6碱碱基基酶酶，则则每每隔隔4096(46)bp会会出出现现一一个识别位点。个识别位点。Not I(8bp)=1/48 65536，稀稀切切酶酶（rar cutters）:指指识识别别序序列列长长和和识识别别序序列列富富含含GC或或富富含含AT的的限限制制性性核核酸内切酶。

17、酸内切酶。仅是理论推测.3/21/202316欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列BamH I 和和Bst I具有具有相同的识别序列相同的识别序列G GATGC同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。两两个个同同尾尾酶酶形形成成的的黏黏性性末末端端连连接接之之后后，一一般般情情况况下下连连接接处处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如：不能够再被其任何一种同尾酶识别。如：BamH I 识别

18、序列：GGATCCBgl II 识别序列：AGATCT.3/21/202317欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确远距离裂解酶(distant cleavage)：识别位点与切割位置不一致。如：Faq I GGGAC(10/14)5-GGGACNNNNNNNNNNNNNNNN-33-CCCTGNNNNNNNNNNNNNNNN-3可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。如：BseJ I GATNNNNATCSubset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中。如：Ehe I GGCGCC Hin

19、6I GC GC.3/21/202318欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.4 限制性内切酶的切割位点限制性内切酶的切割位点切割位点：切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，在限制性核酸内切酶的作用下，两条链断开的位置。两条链断开的位置。一般在识别序列的内部或两侧附近。一般在识别序列的内部或两侧附近。以以 或或 表示。表示。环状环状DNA分子上某个限制性内切酶有分子上某个限制性内切酶有n识别位点，识别位点，完全切割得到完全切割得到n个个DNA片段。片段。线性线性DNA分子，则会得到分子，则会得到

20、n+1个个DNA片段。片段。.3/21/202319欢迎同学们听课！Restriction digestsRestriction digestsdigestion of plasmid or genomic DNA,for analytical or preparative purposes,using commercial enzymes and buffer solutions.All RE require Mg2+,usually at a concentration of up to 10mM,but different enzymes require different pHs,Na

21、Cl concentrations or other solution constituents for optimum activity.3/21/202320欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.5 限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式交错切割（交错切割（staggered cut）:DNA双链断开的位置对称地分布在识别序列中心位双链断开的位置对称地分布在识别序列中心位置的两侧，使切割后的置的两侧，使切割后的DNA末端为单链突出的黏性末端。末端为单链突出的黏性末端。如：如：BamH I -

22、G GATG C-C CTACG-平切割：平切割：DNA双链断开的位置处在识别序列的对称中心，使双链断开的位置处在识别序列的对称中心，使切割后的切割后的DNA末端为平齐的平末端。末端为平齐的平末端。如：如：Nsb I TGC GCA.3/21/202321欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确粘性末端粘性末端 和平末端和平末端粘性末端粘性末端(cohesive terminus/sticky ends)：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的具有突出单链的

23、DNA末端通过互补配对粘合，这样末端通过互补配对粘合，这样的的DNA末端，称为粘性末端。末端，称为粘性末端。3粘性末端：粘性末端：3 突出的黏性末端（突出的黏性末端（DNA末端的末端的3端端比比5 长）长）5 粘性末端：粘性末端：5 突出的黏性末端（突出的黏性末端（DNA末端的末端的5端端比比3 长）长）平末端（平末端（blunt ends）：）：DNA片段的末端是平齐的。片段的末端是平齐的。.3/21/202322欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确同尾酶（同尾酶（isocaudamer）指指来来源源不不

24、同同，识识别别序序列列不不同同，但但可可以以产产生生相相同同黏性末端黏性末端的限制性内切酶。的限制性内切酶。两两个个同同尾尾酶酶形形成成的的黏黏性性末末端端连连接接之之后后，一一般般情情况况下下连连接接处处不不能能够够再再被被其其任任何何一一种种同同尾尾酶酶识识别别。如：如：BamH I 识别序列：GGATCCBgl II 识别序列：AGATCT.3/21/202323欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系限制性核酸内切酶的反应体系2.1.6.1 底物底物DNA2.1.6

25、.2 酶量酶量2.1.6.3 反应缓冲液反应缓冲液2.1.6.4 反应温度反应温度.3/21/202324欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.6.1 底物底物DNA进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 g DNA。一般来说，要用 2 3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。进行大量酶切时，先要确定 RE

26、 的浓度。一般 1U RE 于 37 条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 g DNA。一般来说，要用 2 3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。水稻基因组的EcoR I酶切.3/21/202325欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.6.2 酶量酶量根据根据酶的活性酶的活性和和DNA底物的量底物的量而定。而定。限制性核酸内切限制性核酸内切酶活性单位酶活性单位定义：定义

27、：在在酶酶的的最最适适反反应应条条件件下下，在在50l容容积积中中，60分分钟钟内内完完全全切切割割1 g DNA所所需需的的酶酶量量为为1个酶活性单位（个酶活性单位（unit 或或U）与与DNA分子上分子上识别位点的密度识别位点的密度有关：有关：密度大用酶量多；密度小用酶量少。密度大用酶量多；密度小用酶量少。.3/21/202326欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.6.3 反应缓冲液反应缓冲液Tris-HCl or Tris-HAcMgCl2 or MgAc2KAc or NaCl二硫基苏糖醇二

28、硫基苏糖醇(DTT)or -巯基乙醇巯基乙醇(ME)牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA)pH 7.58.0 at 37 C.3/21/202327欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.6.4 反应温度和时间反应温度和时间大多数限制酶的大多数限制酶的反应温度反应温度为为370C。个个别别特特殊殊的的内内切切酶酶则则需需要要在在300C、500C、600C或或650C的温度下进行切割。的温度下进行切割。反反应应时时间间：一一般般在在适适宜宜的的缓缓冲冲液液和和温温度度条条件件下下，每微克每微克DNA用用15

29、单位的酶，保温单位的酶，保温12小时。小时。.3/21/202328欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性限制性核酸内切酶的星活性星活性（星活性（star activity）：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的非特异性的DNA片段的现象。片段的现象。易产生星活性的内切酶用易产生星活性的内切酶用*标记。如：标记。如：EcoR I*.3/21/

30、202329欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确引起星活性的原因：引起星活性的原因：若使用若使用buffer不當不當,會有會有star activity，而，而star activity是指限制酶對所作用的是指限制酶對所作用的DNA及及序列失去專一性序列失去專一性,當酶辨認切割位置的能力降低，導致當酶辨認切割位置的能力降低，導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產生錯誤的結果。所以當生錯誤的結果。所以當DNA同時以兩種限制酶處理時，同時以兩種限制酶處理

31、時，選擇可使兩種酶之活性反應均可達選擇可使兩種酶之活性反應均可達75以上的以上的restriction buffer，若找不到適當的，若找不到適當的buffer則先加低盐則先加低盐的的buffer使其中一酶作用後，在加入高盐使其中一酶作用後，在加入高盐buffer使另一使另一酶作用，若無法以鹽的高低分別加入不同的酶作用，若無法以鹽的高低分別加入不同的buffer，則，則先加入一種先加入一種buffer作用後，加作用後，加3M NaOAc/95alcohol沉澱沉澱DNA，再加另一種，再加另一種buffer作用。作用。.3/21/202330欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着

32、问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.8 限制性核酸内切酶对限制性核酸内切酶对DNA的消化作用的消化作用单酶切单酶切:加单一酶加单一酶双酶切双酶切:加两种酶加两种酶部分酶切部分酶切:一般通过控制酶切时间一般通过控制酶切时间,使使DNA部分酶切部分酶切底物位点优势效应:酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同.3/21/202331欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.1.9 酶切注意事项酶切注意事项选择正确的酶选择正确的酶DNA的纯度和浓度的纯度和浓度反反

33、应应体体系系甘甘油油的的量量5%（酶酶保保存存在在50甘甘油油中中，故故所所加加酶酶液液体体积积最多为酶切反应总体积的最多为酶切反应总体积的1/10）。）。酶保存在酶保存在200C；使用时在冰浴上操作。；使用时在冰浴上操作。反应体系各成分都加完后，再加酶。反应体系各成分都加完后，再加酶。每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。酶切样品多时，可先取一定量的酶液，稀释后再分装。酶切样品多时，可先取一定量的酶液，稀释后再分装。防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂等。防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂等。.3/21/202332欢迎同学们听

34、课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.2 甲基化酶甲基化酶 在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。（一）大肠杆菌中的甲基化酶（一）大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶甲基化酶:可在可在5GATC3序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如如Bcl I（TGATCA），但），但BamH I（GGATAA）则不会

35、因为则不会因为N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。对底物的特异性不同。dcm甲基化酶甲基化酶 此酶在序列此酶在序列5CCAGG3或或5CCTGG3中的胞嘧啶中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是制性内切酶是EcoR II。.3/21/202333欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确（二）（二）甲基化酶在基因工程中用途甲基化酶在基因工程中用途许多许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化

36、酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：割。如：M.EcoRI催化催化s-腺苷腺苷-L-甲硫氨酸甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到）的甲基转移到EcoR I识别顺序中的第识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使三位腺嘌呤上，从而使DNA免受免受EcoR I的切割。的切割。.3/21/202334欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.3 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)2.3.1 E.

37、coli 和和T4 DNA连接酶连接酶2.3.2 DNA片段之间的连接片段之间的连接2.3.2.1 具黏性末端的具黏性末端的DNA片段之间的连接片段之间的连接2.3.2.2 具平末端具平末端DNA片段之间的连接片段之间的连接2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接片段末端修饰后进行连接2.3.2.4 DNA片段加连杆（片段加连杆（linker）后的连接）后的连接.3/21/202335欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.3.1 DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）来源于来源于T4T4噬菌体感

38、染的大肠杆菌，噬菌体感染的大肠杆菌，催化双链催化双链DNA片段紧靠在一起的片段紧靠在一起的3羟基末端和羟基末端和5 磷酸基磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键。团末端之间形成磷酸二酯键。用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。提取：许多原核和真核生物及病毒中。.3/21/202336欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确E.coli DNA ligase和和T4 DNA连接酶连接酶E.coli DNA ligase:Mr=74000,作用于作用于 5端带磷酸基团的端带磷酸基团

39、的DNA底物底物NAD+可促进该催化反应可促进该催化反应分子克隆使用不多，亦不能连接分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。用途用途:cDNA第二链合成。第二链合成。.3/21/202337欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确T4 DNA ligase:一条多肽链一条多肽链(Mr=68000)(Mr=68000)，还可作用于，还可作用于 RNA,RNA,但效率低得多但效率低得多,需需ATPATP作辅因子。作辅因子。日常日常用的最多。用的最多。T4 RNA ligase:由噬菌体编码由噬菌体编码催化单链催化单链D

40、NA或或RNA连接连接。主要用途是对主要用途是对RNA进行进行3末端标记末端标记.3/21/202338欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.3.2.1 具黏性末端的具黏性末端的DNA片段之间的连接片段之间的连接一般较好连接，直接加入缓冲液和一般较好连接，直接加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。连接酶就可以完成。.3/21/202339欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.3.2.2 具平末端具平末端DNA片段

41、之间的连接片段之间的连接连接效率较粘性末端低，尽量避免采用。加入缓冲液和加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。连接酶就可以完成。.3/21/202340欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确affecting factorsT：多数内切酶产生的粘性末端的：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在值在15以以下下,然而保持连接酶活性的最适温度却是然而保持连接酶活性的最适温度却是37,因此最适温度是粘性末端的因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适值和连接酶最适温度的折衷。经常采用温度的折衷。经常采用12.5（4

42、-15）。）。DNA concentrations：外源片段浓度比载体：外源片段浓度比载体DNA浓度高浓度高10-20倍倍防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体time：O/N better.3/21/202341欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接片段末端修饰后进行连接DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，也称人工接尾片段末端同聚物加尾后进行连接，也称人工接尾法：在末端核苷酸转移酶的催化下，在连接处的末端法：在末端核苷酸转移酶的催

43、化下，在连接处的末端分别加上分别加上AAA，另一端加上，另一端加上TTT。粘性末端修饰成平末端后进行连接：一端是粘端，另粘性末端修饰成平末端后进行连接：一端是粘端，另一端是平端。一端是平端。DNA片段片段5端脱磷酸化作用后连接：防止自身连接环端脱磷酸化作用后连接：防止自身连接环化。化。.3/21/202342欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.3.2.4 DNA片段加连杆（片段加连杆（linker）后的连接）后的连接连杆连杆/衔接物（衔接物（linker）：化学合成的：化学合成的812个核苷酸组个核苷酸

44、组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片片段连接。段连接。衔接头衔接头/接头（接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。都具都具平末端平末端的两种的

45、两种DNA片段的加连杆的连接片段的加连杆的连接分别具分别具平末端和粘性末端平末端和粘性末端的两种的两种DNA片段的加连杆的连片段的加连杆的连接接分别分别具非互补粘性末端具非互补粘性末端的两种的两种DNA片段加连杆的连接片段加连杆的连接.3/21/202343欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.4 聚合酶聚合酶2.4.1 DNA聚合酶聚合酶2.4.2 反转录酶反转录酶2.4.3 RNA 聚合酶聚合酶.3/21/202344欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一

46、定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.4.1 DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase)E.coli（全酶）（全酶）DNA聚合酶聚合酶IKlenow片段片段T7 DNA聚合酶聚合酶Taq DNA 聚合酶聚合酶性性质质53 聚合酶聚合酶35 外切酶外切酶53 外切酶外切酶53 聚合酶聚合酶35 外切酶外切酶无小亚基活性无小亚基活性53 聚合聚合酶酶35 外切外切酶酶聚合速度和持聚合速度和持续合成能力强续合成能力强53 聚合酶聚合酶耐高温耐高温持续合成能力高持续合成能力高用用途途缺口翻译法合缺口翻译法合成放射性标记的成放射性标记的探针探针使粘性末端转使粘性末端转换为平末端换为平末端随

47、机引物法合成随机引物法合成放射性标记探针放射性标记探针修补修补3 隐蔽的隐蔽的粘性末端为平末粘性末端为平末端端DNA 3 末端标末端标记记cDNA第二链的第二链的合成合成测序酶测序酶DNA 3 末端末端标记标记使粘性末端转使粘性末端转换为平末端换为平末端PCR.3/21/202345欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.4.2 反转录酶反转录酶(reverse transcriptase)依依 赖赖 RNA的的 DNA聚聚 合合 酶酶（RNA-dependent DNA polymerase）最最常常见见

48、的的商商用用反反转转录录酶酶：来来源源于于禽禽类类骨骨髓髓母母细细胞胞瘤瘤病病毒毒（avian myeloblastosis virus,AMV）。）。AMV反转录酶具有反转录酶活性和反转录酶具有反转录酶活性和RNaseH活性活性反反转转录录酶酶活活性性可可以以单单链链RNA或或DNA为为模模板板，以以寡寡聚聚脱脱氧氧胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷olig(dT)或或随随机机寡寡聚聚脱脱氧氧核核苷苷酸酸为为引引物物合合成成同同模模板板序序列列互互补补的的互互补补链链。但但DNA指指导导的的DNA聚聚合合酶酶特特性性，不不具具有有35 外外切切酶酶活活性性，聚聚合合时时无无校校正功能。正功能。RNas

49、eH具具有有核核酸酸外外切切酶酶活活性性，能能以以53 或或35 方向特异地降解方向特异地降解RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链。链。最主要的用途：以最主要的用途：以mRNA为模板合成为模板合成cDNA。.3/21/202346欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.4.3 RNA 聚合酶聚合酶(RNA polymerase)以以DNA为模板合成为模板合成mRNA，不需引物，但必须有，不需引物，但必须有启动子。启动子。常用的常用的RNA聚合酶来源与聚合酶来源与SP3、T3和和T7噬菌体。噬菌体。

50、用途：用途：RNA探针的合成。探针的合成。.3/21/202347欢迎同学们听课！在整堂课的教学中，刘教师总是让学生带着问题来学习，而问题的设置具有一定的梯度，由浅入深，所提出的问题也很明确2.5 修饰酶修饰酶末端转移酶末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl trasnferase/terminal transferase)：不依赖于DNA的DNA聚合酶，来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3端增加一个或多个脱氧核苷酸。T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶(bacteriophage T4 polynucleotide kinase)(next page)碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶