微生物检验-第四章-细菌耐药检验课件.ppt

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1、第十一章第十一章 细菌耐药性检测细菌耐药性检测1.1.葡萄球菌属的天然耐药葡萄球菌属的天然耐药对第一代喹诺酮类天然耐药。对第一代喹诺酮类天然耐药。腐生葡萄球菌对磷霉素天然耐药。腐生葡萄球菌对磷霉素天然耐药。耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌对所有耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌对所有-内内酰胺类抗菌药物耐药。包括酰胺类抗菌药物耐药。包括青霉素类、头孢青霉素类、头孢菌素类、含酶抑制剂的复合制剂、碳青霉烯菌素类、含酶抑制剂的复合制剂、碳青霉烯类、氨曲南、头霉素类。类、氨曲南、头霉素类。2.2.肠球菌的天然耐药肠球菌的天然耐药对一、二、三、四头孢菌素、克林霉素、对一、二、三、四头孢菌素、克林霉素、磺胺类、氨基

2、糖苷类（高浓度除外）天然磺胺类、氨基糖苷类（高浓度除外）天然耐药。耐药。可选范围：青霉素、氨苄西林、万古霉素、可选范围：青霉素、氨苄西林、万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、头孢硫脒等。替考拉宁、利奈唑胺、头孢硫脒等。3.3.链球菌天然耐药链球菌天然耐药肺炎链球菌对第一代喹诺酮类药物耐药，并对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星敏感性低。链球菌对氨基糖苷类天然耐药或对水平耐药。4.4.李斯特菌天然耐药李斯特菌天然耐药对磺胺类、杆菌肽、多粘菌素、头孢菌素类天然耐药。细菌的常见耐药机制 细菌耐药机制主要有四种：1.产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；2.抗生素作用的靶位改

3、变，包括青霉素结合蛋白位点、抗生素作用的靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋酶、解旋酶、DNA拓扑异构酶拓扑异构酶的改变等；的改变等；3.细菌膜的通透性下降，包括细菌生物被膜的形成和通细菌膜的通透性下降，包括细菌生物被膜的形成和通道蛋白丢失；道蛋白丢失；4.细菌主动外排系统的过度表达。细菌主动外排系统的过度表达。在上述耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。-内酰胺酶 内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中；检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便

4、、快速，应用于临床检测。超广谱-内酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶；ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂所抑制；ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。超广谱-内酰胺酶（ESBLs）稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL：头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC2g/mL或头孢泊肟MIC8g/mL 超广谱-内酰胺酶（ESBLs）纸片法，出现以下一种情况即可怀疑

5、该菌株产生ESBL（筛选阳性）：头孢泊肟17mm头孢他啶22mm头孢噻肟27mm头孢曲松25mm氨曲南 27mm超广谱-内酰胺酶（ESBLs）纸片法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任一复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差5mm时，即可判断该菌产ESBL。超广谱-内酰胺酶（ESBLs）稀释法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。AmpC酶的特征AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的型

6、内酰胺酶，可分为诱导酶和非诱导酶。与ESBLs不同的是，AmpC酶对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。AmpC酶的检测方法头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法；除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpC Disk、头孢西丁琼脂基础法等。碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素活性的-内酰胺酶，主要分布于-内酰胺酶A、B、D类中。根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类：一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类

7、-内酰胺酶；另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类-内酰胺酶。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）携带SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PBP2a，这种蛋白对甲氧西林和其他的-内酰胺类抗生素亲和力下降，从而导致对这些抗生素的耐药。SCCmec主要由mec复合物和ccr复合物两部分组成。根据不同mec复合物和ccr复合物的组合，可以将SCCmec分成不同的型别，目前已发现8种SCCmec型。耐甲氧西林葡萄球菌耐甲氧西林葡萄球菌的检测MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶

8、凝胶试验检测PBP2a、mecA基因测定及MRSA显色培养基。头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。对于金黄色葡萄球菌，MRSA的检测可以使用苯唑西林纸片，但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS）MRS检测药物纸片法稀释法金黄色葡萄球菌1g 苯唑西林路邓葡萄球菌1g 苯唑西林金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌30g 头孢西丁除路邓以外的凝固酶阴性葡萄球菌1g 苯唑西林30g 头孢西丁凝固酶阴性葡萄球菌中苯唑西林MIC结果的报告策略*苯唑西林苯唑西林苯唑西林苯唑西林 MIC(MIC(g/ml)g/ml)进行进行进行进行 m

9、ecmecA A 或或或或 PBP2a PBP2a 或或或或头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散 0.250.25 4.04.00.5-2.00.5-2.0报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报报告苯告苯告苯告苯唑唑西林耐西林耐西林耐西林耐药药阴性阴性阴性阴性阳性阳性阳性阳性报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药报告苯唑西林耐药*检测无菌部位感染的检测无菌部位感染的 非表皮葡萄球菌菌株非表皮葡萄球菌菌株克林霉素诱导耐药葡萄球菌红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或仅对红霉素耐药。*或其他大环内酯

10、类机制机制机制机制耐药基因耐药基因耐药基因耐药基因红霉素红霉素红霉素红霉素克林霉素克林霉素克林霉素克林霉素核糖体修饰核糖体修饰核糖体修饰核糖体修饰-药物不能结药物不能结药物不能结药物不能结合于靶位合于靶位合于靶位合于靶位ermermR RS*S*R RR R结构性结构性结构性结构性泵泵泵泵-药物被泵出药物被泵出药物被泵出药物被泵出msrmsrA AR RS Sermerm=erythromycin ribosome=erythromycin ribosome methylasemethylasemsrAmsrA=macrolidemacrolide streptograminstreptogr

11、amin resistance resistance*需要诱导来显示耐药性需要诱导来显示耐药性 红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制诱导性克林霉素耐药（诱导性克林霉素耐药（erm介导）介导）葡萄球菌-“D试验”患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药无克林霉素诱导（无克林霉素诱导（msrA介导）介导）真的克林霉素敏感真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感报告克林霉素敏感“D”阳性阳性阴性阴性15 15 26 mm 26 mm葡萄球菌诱导性克林霉素耐药的MIC检测方法4.04.0 g/ml g/ml 红霉素红霉素 0.50.5 g/ml g/ml 克林霉素克林霉素No growthNo growt

12、h=无诱导性克林霉素无诱导性克林霉素耐药耐药生长生长=诱导性克林霉素耐药诱导性克林霉素耐药对于红霉素耐药，克林霉素敏感的葡萄球菌，需检测诱导性克林霉素耐药注意试验适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐药株)；对于CoNS，该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌；大多数医院相关MRSA是克林霉素耐药的；大多数社区相关MRSA是克林霉素敏感的(msrA 基因型)；克林霉素可以口服给药。万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌（VISA）耐药是由于：耐药是由于：耐药是由于：耐药是由于：增厚的细胞壁增厚的细胞壁增厚的细胞壁增厚的细胞壁检测检测检测检测困难；表型不稳定困难；表型

13、不稳定困难；表型不稳定困难；表型不稳定菌落形态菌落形态菌落形态菌落形态不典型金葡菌不典型金葡菌不典型金葡菌不典型金葡菌万古霉素敏感万古霉素敏感万古霉素中介万古霉素中介细胞壁细胞壁当有以下一个或多个情况时菌株可疑为当有以下一个或多个情况时菌株可疑为VISA-內酰胺类药物的內酰胺类药物的MIC降低降低达托霉素达托霉素MIC升高升高菌落形态不典型（一些为微小菌落）菌落形态不典型（一些为微小菌落）肉汤中生长迟缓（如血培养）肉汤中生长迟缓（如血培养）凝固酶反应微弱凝固酶反应微弱/延迟延迟经过几次次代经过几次次代培养后：培养后：菌落回复为典型形态菌落回复为典型形态万古霉素万古霉素MIC降低并且菌株变为万古

14、霉素敏感降低并且菌株变为万古霉素敏感万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（VRSA）耐药是由于耐药是由于耐药是由于耐药是由于 从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（VREVRE）中获得）中获得）中获得）中获得vanAvanA基因基因基因基因 美国报道例数美国报道例数美国报道例数美国报道例数 9 9个患者个患者个患者个患者检测检测检测检测 大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测菌落形态菌落形态菌落形态菌落形态 典型金葡菌典型金葡菌典型金葡菌典型金葡菌纸片扩散法折点纸片扩散法折点葡萄球菌葡萄球菌-万古霉素万

15、古霉素CLSI CLSI 文件文件文件文件SusceptibleSusceptible敏感敏感敏感敏感IntermediateIntermediate中介中介中介中介ResistantResistant耐药耐药耐药耐药M100-S18 2008M100-S18 2008 1515-New!New!新新新新M100-S19 M100-S19 2009*2009*-CLSI M100-S19.Table 2C.CLSI M100-S19.Table 2C.对于金黄色葡萄球菌对于金黄色葡萄球菌*假如抑菌圈假如抑菌圈7 mm7 mm，用用MICMIC法检测万古霉素法检测万古霉素（若有需要）（若有需要）

16、万古霉素纸片扩散法仅在检测携带万古霉素纸片扩散法仅在检测携带万古霉素纸片扩散法仅在检测携带万古霉素纸片扩散法仅在检测携带van-Avan-A金葡菌（金葡菌（金葡菌（金葡菌（VRSAVRSA）时可信；需确证）时可信；需确证）时可信；需确证）时可信；需确证没有抑菌圈没有抑菌圈没有抑菌圈没有抑菌圈 (6 mm)(6 mm)纸片扩散法不能鉴别纸片扩散法不能鉴别纸片扩散法不能鉴别纸片扩散法不能鉴别VSSAVSSA和和和和VISAVISA 纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌肠球菌肠球菌高水平氨基糖

17、苷类耐药筛查高水平氨基糖苷类耐药筛查纸片扩散法120 g 庆大霉素;300 g 链霉素 10 mm=无高水平氨基糖苷类耐药MIC筛查庆大霉素:500 g/ml 链霉素:1000 g/ml(肉汤)2000 g/ml(琼脂)肠球菌氨基糖苷类修饰酶 链霉素 庆大霉素 妥布霉素 阿米卡星/丁胺卡那6-AAD +-3APH -+2”APH/6AAC -+6AAC*-+*在所有屎肠球菌中均发现+=+=酶可以修饰药物；药物无协同性酶可以修饰药物；药物无协同性-=-=酶不能修饰药物；药物有协同性酶不能修饰药物；药物有协同性万古霉素耐药肠球菌（VRE）表型VRE屎肠球菌中居多屎肠球菌中居多vanA-高水平耐药高

18、水平耐药(MIC 256 g/ml)vanB-中等水平耐药中等水平耐药(MIC 16-256 g/ml)低水平万古霉素耐药低水平万古霉素耐药vanC-(MIC 2-16 g/ml)vanC天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌菌株不引起院内爆发，菌株不引起院内爆发，vanC基因不易于传播基因不易于传播纸片扩散法实验可能检测不出纸片扩散法实验可能检测不出快速快速MGPMGP实验，孵育实验，孵育3-53-5小时；甲基化小时；甲基化-a-D-a-D-葡糖苷葡糖苷酸化黄色酸化黄色阳性阳性阴性阴性铅黄肠球菌的黄色色素铅黄肠球菌的黄色色素VRE肺炎链球菌 新的青霉素折点(g/ml

19、)敏感敏感敏感敏感中介中介中介中介耐药耐药耐药耐药青霉素注射青霉素注射青霉素注射青霉素注射 (非脑膜炎非脑膜炎非脑膜炎非脑膜炎)2 24 4 8 8青霉素注射青霉素注射青霉素注射青霉素注射 (脑膜炎脑膜炎脑膜炎脑膜炎)0.060.06-0.10.12 2青霉素青霉素青霉素青霉素 (口服青霉素口服青霉素口服青霉素口服青霉素 V)V)0.060.060.12-10.12-1 2 2CLSI M100-S19.Table 2G.CLSI M100-S19.Table 2G.纸片药物纸片药物纸片药物纸片药物含量含量含量含量抑菌圈抑菌圈抑菌圈抑菌圈 (mm)(mm)MIC MIC(g/ml)g/ml)等

20、等等等效的效的效的效的MICMICR RI IS SR RS S青霉素青霉素青霉素青霉素 1 1 g g 苯唑苯唑苯唑苯唑西林西林西林西林-2020-0.00.06 6CLSI M100-S19.Table 2G.CLSI M100-S19.Table 2G.肺炎链球菌肺炎链球菌纸片扩散法纸片扩散法-使用苯唑西林纸片作为青霉素敏感性的替代纸片使用苯唑西林纸片作为青霉素敏感性的替代纸片20 mm-报告“敏感”：青霉素头孢噻肟/头孢曲松 其他-内酰胺类19 mm-进行MIC实验：青霉素苯唑西林纸片敏感或20 mm 对应脑膜炎或口服青霉素的敏感折点(MIC 0.06 g/ml)CLSI M100-S19.Table 2G.CLSI M100-S19.Table 2G.肺炎链球菌肺炎链球菌纸片扩散法纸片扩散法-使用苯唑西林纸片作为青霉素敏感性的替代纸片使用苯唑西林纸片作为青霉素敏感性的替代纸片肺炎链球菌青霉素Etest MIC结果判读青霉素MIC的Etest测定肺炎链球菌 MIC=3 g/ml