分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用课件.ppt

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1、分子技术在肿瘤靶向药物分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用治疗的应用中南大学病理学系中南大学病理学系 湘雅医院病理科湘雅医院病理科周建华周建华 肿瘤靶向治疗肿瘤靶向治疗（Target therapy of cancer）n依据已知肿瘤发生的异常分子和基因，设计和研发针对这些特定的分子和靶点药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法；n靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶基因变异类存在与否和变异类型；n个体化治疗的雏形。荧光原位杂交（荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）技术技术简介简介nFISH=Fluorescence In Situ Hybridi

2、zationn利用荧光标记的DNA探针检测组织或细胞内与其互补的DNA片段n应用：遗传病诊断 血液肿瘤 实体瘤n样本：羊水、绒毛、流产组织、外周血、骨髓、体液及各种肿瘤组织等用已知的标记单链核酸为探用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在行杂交从而将特定的基

3、因在染色体上定位染色体上定位荧光标记探针探针变性样本DNA变性杂交工作原理工作原理FISH检测染色体易位（检测染色体易位（Translocation）在淋在淋巴瘤分型中的应用巴瘤分型中的应用FISHFISH技术在淋巴造血系统技术在淋巴造血系统肿瘤中的应用肿瘤中的应用检测技术特点检测技术特点n不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同n优点l适用于形态学上难以诊断且IHC结果不理想的标本；l适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织。n必须结合组织形态学和免疫组化结果作最后必须结合组织形态学和免疫组化结果作最后诊断！诊断！FISH基因检测在淋巴瘤的应用基因检测在淋巴瘤的应用淋巴瘤淋巴瘤FISHFISH

4、检测基因检测基因临床应用临床应用套细胞淋巴瘤套细胞淋巴瘤IGH/CCND1IGH/CCND1融合基因融合基因辅助诊断滤泡性淋巴瘤滤泡性淋巴瘤BCL2/IGHBCL2/IGH融合基因融合基因辅助诊断、判断预后弥漫性大弥漫性大B B细胞淋细胞淋巴瘤巴瘤BCL6BCL6基因断裂基因断裂重组重组辅助诊断、判断预后伯基特淋巴瘤伯基特淋巴瘤C-MYCC-MYC基因断裂重组基因断裂重组辅助诊断粘膜相关淋巴组织粘膜相关淋巴组织淋巴瘤淋巴瘤MALTIMALTI基因断裂基因断裂辅助诊断胃胃粘膜相关淋巴组粘膜相关淋巴组织淋巴瘤织淋巴瘤API2-MALTIAPI2-MALTI融合基因融合基因指导治疗弥漫大弥漫大B B

5、细胞淋巴瘤（细胞淋巴瘤（DLBCLDLBCL）按免疫组化亚型分为按免疫组化亚型分为 CD5阳性阳性DLBCL 生发中心生发中心B细胞样变型细胞样变型(GCB)、非生发中心非生发中心B细胞样变型细胞样变型(non-GCB)3类类可根据可根据CD10、BCL6、MUM1的表达区分生发中的表达区分生发中心心B细胞样变型细胞样变型、非生发中心非生发中心B细胞样变型。细胞样变型。30%瘤细胞表达瘤细胞表达CD10或或CD10(-)、BCL-6(+)、MUM-1(-)诊断为诊断为GCB;其他病例则为其他病例则为non-GCB。BCL6 BCL6基因断裂基因断裂-辅助诊断弥漫性大辅助诊断弥漫性大B B细胞淋

6、巴瘤细胞淋巴瘤 BCL6 BCL6基因断裂重排基因断裂重排-判断预后判断预后目前研究确定至少目前研究确定至少40%40%的的DLBCLDLBCL涉及涉及BCL6BCL6基因重排。基因重排。一项针对一项针对102102名名DLBCLDLBCL患者的患者的BCL6BCL6重排情况及其与预后关系的研重排情况及其与预后关系的研究显示，究显示，BCL6BCL6阳性患者诊断治疗阳性患者诊断治疗3636个月后，疾病停止发展的比个月后，疾病停止发展的比率为率为82%82%，携带有，携带有BCL6BCL6重排的病例重排的病例预后较好预后较好。BCL6 BCL6 基因断裂与弥漫性大基因断裂与弥漫性大B B细胞淋巴

7、瘤细胞淋巴瘤Offit,K.N Engl J Med,1994.331(2):p.74-80.结果判读结果判读IGH/CCND1融合基因可见于95%的套细胞淋巴瘤，是套细胞淋巴瘤与其他淋巴瘤鉴别的重要指标。uIGH/CCND1IGH/CCND1融合基因融合基因-辅助诊断套细胞淋巴瘤。辅助诊断套细胞淋巴瘤。IGH/CCND1IGH/CCND1融合基因与套细胞淋巴瘤融合基因与套细胞淋巴瘤l l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。个融合信号。API2/MALT

8、1API2/MALT1基因检测试剂盒基因检测试剂盒 探针：探针：GLP API2/GLP MALT1GLP API2/GLP MALT1凋亡抑制因子凋亡抑制因子2 2基因（基因（apoptosis inhibitor-2,apoptosis inhibitor-2,API2API2）,位于位于1111号染色体号染色体;粘膜相关淋巴组织基因（粘膜相关淋巴组织基因（Mucosa-associated lymphoid tissue 1,MALT1Mucosa-associated lymphoid tissue 1,MALT1 ），），位于位于1818号染色体。号染色体。API2基因与MALT1基

9、因的融合导致凋亡抑制的增加，引起细胞不依赖于抗原刺激的生存优势。u API2/MALT1API2/MALT1融合基因的检测可以指导抗融合基因的检测可以指导抗HPHP治疗治疗 胃胃MALTMALT淋巴瘤与幽门螺旋杆菌（淋巴瘤与幽门螺旋杆菌（HPHP）感染导）感染导致的慢性胃炎有关，致的慢性胃炎有关，MALT1/API2MALT1/API2融合基因阴性的融合基因阴性的患者抗患者抗HPHP治疗有效，阳性患者抗治疗有效，阳性患者抗HPHP治疗无效。治疗无效。API2/MALT1API2/MALT1融合基因检测意义融合基因检测意义 l l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。正常细胞：两个红色信号，两

10、个绿色信号。l l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。个融合信号。BCL2/IGHBCL2/IGH重排发生在约重排发生在约80%-85%80%-85%的的FLFL患者中，检测患者中，检测BCL2/IGHBCL2/IGH基因重排可以辅助诊断基因重排可以辅助诊断FLFL。BCL2/IGHBCL2/IGH阴性的阴性的FLFL患者患者3 3年生存率为年生存率为100%100%，而阳性，而阳性者只有者只有54%54%；阴性者阴性者3 3年疾病无进展为年疾病无进展为87.5%87.5%，而，而阳性者只有阳性者只有13%13%。BCL2/IGHBCL

11、2/IGH融合基因与滤泡性淋巴瘤融合基因与滤泡性淋巴瘤n BCL2/IGH融合基因融合基因-辅助诊断滤泡性淋巴瘤辅助诊断滤泡性淋巴瘤n BCL2/IGH融合基因融合基因-判断预后判断预后l l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。个融合信号。结果判读结果判读-阳性结果阳性结果结果判读结果判读-阳性结果阳性结果 约约80%80%的伯基特淋巴瘤病例发生的伯基特淋巴瘤病例发生t(8t(8；14)14)（q24;q32q24;q32）；约约15%15%的伯基特淋巴

12、瘤病例发生的伯基特淋巴瘤病例发生t(2t(2；8)(p11;q24)8)(p11;q24)；约约5%5%发生发生t(8t(8；22)22)（q24;q11q24;q11）。染色体染色体易位导致易位导致C-MYCC-MYC基因断裂重组基因断裂重组可能是伯基特淋可能是伯基特淋巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。助诊断。C-MYCC-MYC基因断裂与伯基特淋巴瘤基因断裂与伯基特淋巴瘤u 辅助诊断伯基特淋巴瘤辅助诊断伯基特淋巴瘤 结果判读结果判读-阳性结果阳性结果FISHFISH技术在乳腺癌靶向治疗应用技术在乳腺癌靶向治疗应用乳腺癌乳

13、腺癌 Her-2基因基因l 致癌基因：致癌基因：Her-2Her-2基因；基因；l 位点：位点：17q11.2-q1217q11.2-q12；l 编码蛋白：跨膜蛋白（与编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）；表皮生长因子受体部分同源）；l 25-30%25-30%乳腺癌病人都有乳腺癌病人都有HER-2HER-2的扩增；的扩增；l HER-2HER-2基因扩增是决定基因扩增是决定HerceptinHerceptin治治疗是否有效的关键性指标。疗是否有效的关键性指标。lHER2HER2扩增的乳腺癌更具有侵袭性生长扩增的乳腺癌更具有侵袭性生长能力。能力。乳腺癌乳腺癌Her-2基因及蛋白检

14、测基因及蛋白检测Cerb-B-2:3+完全强膜阳性细胞完全强膜阳性细胞30%2+,1+,-FISH检测是否有基因扩增检测是否有基因扩增Her2基因基因检测流程检测流程石蜡组织标本石蜡组织标本IHC检测检测再用再用FISH方法检测方法检测1+3+2+Herceptin治疗治疗+再用再用FISH方法检测方法检测Herceptin治疗治疗FISH检测检测+再用再用FISH方法检测方法检测+A.无须计数的大簇团信无须计数的大簇团信号（高度扩增）号（高度扩增）B.颗粒状信号（颗粒状信号（R10，高度扩增）高度扩增）C.须计数的颗粒状信须计数的颗粒状信号（号（R=3.5，低度扩增）低度扩增）ACBHer-

15、2基因扩增状况基因扩增状况30%的肿瘤细的肿瘤细胞全部的细胞膜胞全部的细胞膜高强度着色高强度着色免疫组化免疫组化（3+）与与FISH对比对比 40100浸润性导管癌浸润性导管癌级级IHC：+FISH：呈呈簇团状高度扩增簇团状高度扩增100免疫组化免疫组化（）（）与与FISH扩增阳性扩增阳性浸润性导管癌浸润性导管癌级级IHC：FISH：呈簇状扩增呈簇状扩增肿瘤细胞不着色肿瘤细胞不着色40100基因突变检测方法基因突变检测方法1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage)2.变性梯度凝胶电泳(DGGE)3.杂合双链分析法(HA)4.化学切割错配(CCM)5.碳化二亚胺检测(Carbodiimi

16、de,CDI)6.酶促切割错配(Enzyme Mismatch Cleavage,EMC)7.单链构象多态性(Single-Strand Conformation)8.切割片段长度多态性 9.DNA测序(Sequencing)10.双脱氧指纹图谱法(Dideoxy Finger-printing,ddF)11.错配接合蛋白检测 12.蛋白截短测试（protein truncation test）方法方法13.变性的高效液相色谱检测(Denaturing High Performance Liguld Chromatography DHPLC)14.DNA芯片技术(DNAchip)15.等位基因

17、特异性扩增16.等位基因特异性寡核苷酸片段分析(Allele-Specific Oligonucleotide,ASO)17.引物延伸检测(Primer Extension,PEX)18.寡核苷酸连接检测(Oligonucleotide Ligation Assay,OLA)19.限制性片段分析(Restriction Fragment Analysis）20.突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）21.蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpions amplification refractory mutation system）肺癌组织肺癌组织EGFR基因扩增和基因扩增

18、和突变检测及其临床意义突变检测及其临床意义研究背景研究背景研究显示吉非替尼对部分晚期研究显示吉非替尼对部分晚期NSCLC患者的治疗患者的治疗效果非常效果非常显著显著。存在存在EGFR基因突变的患者更有可能对吉非替尼的基因突变的患者更有可能对吉非替尼的治疗敏感。治疗敏感。存在存在EGFR基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶点基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶点药物更为敏感。药物更为敏感。检测大肠癌有无检测大肠癌有无EGFR过度表达，只要过度表达，只要1%的癌的癌细胞的胞膜强阳性染色即判断为细胞的胞膜强阳性染色即判断为3+，可作为应用，可作为应用西妥昔单抗的指征。西妥昔单抗的指征。n FISH检测检测E

19、GFR基因扩增基因扩增l标本类型：石蜡包埋组织（手术、活检、穿刺）标本类型：石蜡包埋组织（手术、活检、穿刺）冰冻组织冰冻组织 胸、腹水沉渣细胞胸、腹水沉渣细胞l 探针类型：探针类型：GLP EGFR/CSP7n 定量定量PCR检测检测EGFR基因突变分型基因突变分型l 突变类型：突变类型：19 exon（2235-2249位点）位点）15bp缺失突变缺失突变 19 exon（2240-2257位点）位点）18bp缺失突变缺失突变 19 exon（2240-2251位点）位点）12bp缺失突变缺失突变 21 exon 2573位点位点TG碱基置换突变碱基置换突变 21 exon 2582位点位点

20、TG碱基置换突变碱基置换突变 EGFR基因变异检测基因变异检测双体性双体性三体性三体性多体性多体性扩扩 增增EGFR基基 因因 FISH 检检 测测 状状 况况肺肺癌癌石石蜡蜡 FQ-PCR分型技术检测分型技术检测EGFR突变突变存在存在EGFR突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图71例肺癌组织中检测出6例突变样本FQ-PCR 检测检测15bp缺失阳性病例结果缺失阳性病例结果 红色阈值线以上的扩增曲线即为红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧光信阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的高低依次为号值的高低依次为 9 9号、号、1212号、号、1313号、号、55

21、55号、号、3838号和号和3333号标本号标本 15bp缺失突变型缺失突变型DNA的测序图的测序图 senseantisense红色阈值线以上的扩增曲线即红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧为阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的高低依次为光信号值的高低依次为2 2号、号、3636号、和号、和4040号标本号标本 FQ-PCR 检测检测18bp缺失阳性病例结果缺失阳性病例结果 目前目前K-RASK-RAS突变检测常用技术突变检测常用技术方法方法n直接测序直接测序n焦磷酸测序焦磷酸测序n高分辨率熔解曲线高分辨率熔解曲线nPCR-RFLPPCR-RFLPn芯片芯片n杂交杂交nReal

22、-Time PCRReal-Time PCR肿瘤组织的确认和筛选肿瘤组织的确认和筛选显微切割肿瘤显微切割肿瘤提取提取DNA相应的相应的PCR反应或杂交反应或杂交相关的分析和检测相关的分析和检测K-ras突变检测基本流程图直接测序(Direct Sequencing)PCR扩增后产物直接测序n双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)DNA 片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测 K-ras突变检测结果疗效预测标志物与预后判断标志物n疗效预测标志物：疗效预测标志物：能够预测某种特定治疗方式疗效的标记物能够预测某种特定治疗方式疗效

23、的标记物nKRAS基因突变导致肿瘤对基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗抑制剂抵抗n预后判断标志物：预后判断标志物：在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的标在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的标记物记物n18号染色体长臂（号染色体长臂（18q）缺失缺失 n某些分子标志物兼具两种作用某些分子标志物兼具两种作用n胸腺嘧啶合成酶（胸腺嘧啶合成酶（Thymidylate synthase）EGFR EGFR 作为预后因子的价值作为预后因子的价值EGFR expression correlates with poor prognosisDFS=Disease-free survival;OS=

24、overall survivalTumor typePrognosisSurvivalRisk of metastasisReferencesColorectalPoorPoor-Decreased OSIncreased-Hemming(1992)Mayer,De Jong(1992)Head&Neck(SCCHN)PoorPoorDecreased DFSDecreased OS-Grandis(1998)Maurizi(1996)Lung(NSCLC)PoorPoorDecreased OS -IncreasedOhsaki(2000)Pavelic(1993)nCetuxamab(西妥

25、昔单抗西妥昔单抗)n人源化嵌合单抗（人源化嵌合单抗（IgG1）n靶向作用于表皮生长因子受体（靶向作用于表皮生长因子受体（EGFR）n阻断阻断EGF 和和TGF与与EGFR 的结合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的结合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的肿瘤生长的肿瘤生长n200年获得FDA审批资格治疗结直肠癌nPanitumumab（帕尼单抗）帕尼单抗）n完全人源化单克隆抗体完全人源化单克隆抗体(IgG2)n靶向作用于表皮生长因子受体（靶向作用于表皮生长因子受体（EGFR）n2005年7月获得FDA快速通道审批资格治疗结直肠癌结直肠癌分子靶向治疗药物结直肠癌分子靶向治疗药物 KRAS KRAS 突变突变nK

26、RAS 突变可不依赖突变可不依赖EGFR受体途径，自行激活受体途径，自行激活RAS/MAPK 通路通路n导致导致ERBITUX 耐药耐药nKRAS 突变与突变与Erbitux疗效及患者生存相关疗效及患者生存相关nKRAS 突变并非孤立事件突变并非孤立事件nKRAS 突变常伴随突变常伴随BRAF突变，并与突变，并与 CpG 岛甲基化表型岛甲基化表型(CIMP)1,2相关相关nKRAS 突变常伴随突变常伴随 PI3K 突变突变3 Livre A,et al.J Clin Oncol 2008;26:374379MAPK=mitogen-activated protein kinaselK-rasr

27、as基因野生型患者能从这类药物治疗中获益。基因野生型患者能从这类药物治疗中获益。lK-K-rasras基因突变型患者并不能从抗基因突变型患者并不能从抗EGFREGFR治疗中获益治疗中获益,反而反而徒增不良反应危险和治疗费用；徒增不良反应危险和治疗费用；抗抗EGFR治疗和治疗和K-ras突变相互排斥突变相互排斥K-K-rasras基因抗基因抗EGFREGFR治疗关系密切治疗关系密切n2009年年7月月FDA批准了对西妥昔单抗和帕尼批准了对西妥昔单抗和帕尼单抗说明书标签的修改：单抗说明书标签的修改：结直肠癌分子靶向治疗药物结直肠癌分子靶向治疗药物 注明注明KRAS基因突变的结直肠癌患者不推荐这基因

28、突变的结直肠癌患者不推荐这使用这两种用药物。使用这两种用药物。l K-K-rasras基因突变基因突变:20-60%:20-60%结直肠癌结直肠癌l K-K-rasras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原发灶和转移灶的发灶和转移灶的K-K-rasras基因高度保持一致基因高度保持一致K-ras基因突变基因突变 NCCNNCCN临床实践指南临床实践指南指南明确指出所有转移性结直肠癌患者指南明确指出所有转移性结直肠癌患者 都应检测都应检测K-K-rasras基因状态。基因状态。美国美国美国临床肿瘤学会美国临床肿瘤学会(ASCO)ASCO)推荐把推荐把K-K-rasra

29、s基因突变检测作为基因突变检测作为 结直肠癌患者接受结直肠癌患者接受EGFREGFR单抗治疗的预测指标。单抗治疗的预测指标。欧盟药品审评管理局规定：欧盟药品审评管理局规定：cetuximabcetuximab 及及p panitumumabanitumumab 用于用于mCRCmCRC的治疗前，患者必须确定为的治疗前，患者必须确定为K-K-rasras野生型。野生型。K-ras与结直肠癌治疗与结直肠癌治疗结直肠癌（结直肠癌（CRCCRC）缺乏）缺乏EGFREGFR基因突变基因突变n对爱必妥单药治疗转移性结直肠癌对爱必妥单药治疗转移性结直肠癌（mCRC）临床试验中）临床试验中110例活检标本例活

30、检标本进行的研究未发现进行的研究未发现 EGFR基因突变基因突变（外显子（外显子1821）Khambata-Ford S,et al.J Clin Oncol 2007;25:32303237抗EGFR治疗前检测KRAS基因突变的理由1.避免不必要的不良反应避免不必要的不良反应2.控制不必要的费用控制不必要的费用3.确认能够从治疗中获益的野生型患者确认能够从治疗中获益的野生型患者4.避免治疗对突变型患者的潜在毒性避免治疗对突变型患者的潜在毒性CHMP gave a positive opinion for ERBITUX May 29,2008 but for patients with wi

31、ld-type KRAS tumorsn810810名胃癌病人有名胃癌病人有HER2HER2基因的扩增，约占参与实验总人基因的扩增，约占参与实验总人数的数的22%22%；n晚期胃癌接受标准化疗联合晚期胃癌接受标准化疗联合HerceptinHerceptin治疗的患者：治疗的患者：平平均生存期由均生存期由11.111.1个月延长到个月延长到13.813.8个月；个月；高倍扩增者甚至可达高倍扩增者甚至可达1616个月；个月；将死亡风险降低将死亡风险降低26%26%。HER2HER2与胃癌分子靶向治疗与胃癌分子靶向治疗美国临床肿瘤学会美国临床肿瘤学会ASCOASCO提出：提出：u Herceptin

32、Herceptin可成为可成为HER2HER2阳性晚期胃癌患者的阳性晚期胃癌患者的 治疗选择。治疗选择。u 晚期胃癌患者在确诊时都应接受晚期胃癌患者在确诊时都应接受HER2HER2检测；检测；HERHER基因与胃癌预后基因与胃癌预后HER2HER2基因扩增的晚期胃癌患者往往预后不佳。基因扩增的晚期胃癌患者往往预后不佳。n无无HER2HER2基因扩增的晚期胃癌患者中位生存期基因扩增的晚期胃癌患者中位生存期12.612.6个月，而有基因扩增者中位生存期仅个月，而有基因扩增者中位生存期仅5.55.5个月。个月。n存在存在HER2HER2基因扩增的胃癌患者术后基因扩增的胃癌患者术后5 5年生存率为年生存率为21.4%21.4%，而无扩增的则为，而无扩增的则为63.0%63.0%。