串联亲和纯化技术的研究进展课件.ppt

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1、卷首语卷首语 背景介绍背景介绍第一章第一章 TAPTAP的原理与方法的原理与方法 第二章第二章 TAPTAP技术的应用技术的应用 第三章第三章 TAPTAP技术改进技术改进 第四章第四章 存在的问题存在的问题结束语结束语组员表组员表 随着确定细胞内蛋白质的相互作随着确定细胞内蛋白质的相互作用成为当今生命科学的研究热点，用成为当今生命科学的研究热点，双杂交技术已经广泛应用于研究双杂交技术已经广泛应用于研究蛋白一蛋白间的相互作用，但由蛋白一蛋白间的相互作用，但由于其筛选步骤复杂，假阳性结果于其筛选步骤复杂，假阳性结果较多，难于量化，故不能满足大较多，难于量化，故不能满足大规模蛋白质研究的需要，因此

2、规模蛋白质研究的需要，因此串串联亲和纯化联亲和纯化(Tandem Affinity Purification。TAP)技术以其高技术以其高效、高纯度、以及能够高度模拟效、高纯度、以及能够高度模拟真实生理条件等优势，真实生理条件等优势，迅速成为迅速成为筛选、发现和鉴别新的相互作用筛选、发现和鉴别新的相互作用蛋白质的主流技术之一。蛋白质的主流技术之一。卷首语卷首语 背景介绍背景介绍目前，目前，TAP技术技术与与质谱技术质谱技术的联的联用，以及质谱技术的用，以及质谱技术的自动化自动化，使，使得大规模地分析相互作用的蛋白得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上成为可能。质在技术上成为可能。TAP 采用两

3、步亲和纯化，提高了采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性，具有周期短、纯化产物的特异性，具有周期短、假阳性结果少等优点。通过这种假阳性结果少等优点。通过这种方法鉴定出的蛋白质相互作用能方法鉴定出的蛋白质相互作用能真实地反映细胞中蛋白质分子之真实地反映细胞中蛋白质分子之间的联系，实验结果更加接近真间的联系，实验结果更加接近真实情况，而且实情况，而且TAP 技术还特别适技术还特别适用于蛋白质组水平上的大规模研用于蛋白质组水平上的大规模研究。究。串联亲和纯化技术与常规的亲串联亲和纯化技术与常规的亲和纯化技术相比具有更多优点，和纯化技术相比具有更多优点，因为这些优点，因为这些优点，串联亲和纯化串联亲

4、和纯化技术如今已被广泛地用于蛋白技术如今已被广泛地用于蛋白质一蛋白质之间相互作用的研质一蛋白质之间相互作用的研究，尤其是蛋白质复合体的研究，尤其是蛋白质复合体的研究究。TAP技术作为一种高效的在生技术作为一种高效的在生理条件下研究蛋白质相互作用理条件下研究蛋白质相互作用的技术，的技术，它能更加真实地反映它能更加真实地反映细胞内部的客观世界细胞内部的客观世界。因此。因此TAP技术在认识蛋白质相互作技术在认识蛋白质相互作用这一蛋白质组学的重要内容用这一蛋白质组学的重要内容的过程中必将发挥越来越重要的过程中必将发挥越来越重要的作用。的作用。第一节第一节 蛋白质标记蛋白质标记 第二节第二节 构建表达标

5、记蛋白的细胞构建表达标记蛋白的细胞 或组织或组织 第三节第三节 细胞抽提物的准备细胞抽提物的准备第四节第四节 串联亲和纯化串联亲和纯化(TAP)第五节第五节 蛋白质复合体的鉴定蛋白质复合体的鉴定第一章第一章 TAP的原理与方法的原理与方法 运用运用TAP技术纯化蛋白技术纯化蛋白质复合体的质复合体的流程流程主要包主要包括构建表达标记蛋白的括构建表达标记蛋白的细胞或组织、准备细胞细胞或组织、准备细胞抽提物、串联亲和纯化抽提物、串联亲和纯化和分析鉴定。和分析鉴定。TAP技术通过在目的蛋白的一端嵌入一段由技术通过在目的蛋白的一端嵌入一段由金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A(ProA)的的IgG结合

6、区和钙结合区和钙调蛋白结合区调蛋白结合区(CBP)构成，中间被一个构成，中间被一个TEv蛋蛋白酶的酶切位点隔开的蛋白质标记。当蛋白质白酶的酶切位点隔开的蛋白质标记。当蛋白质标记在目标蛋白的两端时，这两段结合区的顺标记在目标蛋白的两端时，这两段结合区的顺序有所不同，但始终要保证最终表达的融合蛋序有所不同，但始终要保证最终表达的融合蛋白中蛋白白中蛋白A的的IgG结合区在外端结合区在外端(见图见图1)。这样。这样使得被标记的目的蛋白其表达量与其在细胞中使得被标记的目的蛋白其表达量与其在细胞中自然表达水平相当，避免了由于过量表达导致自然表达水平相当，避免了由于过量表达导致非自然条件下的蛋白质相互作用。

7、通过两步连非自然条件下的蛋白质相互作用。通过两步连续的亲和纯化获得更接近自然状态的特定蛋白续的亲和纯化获得更接近自然状态的特定蛋白质复合体。质复合体。1.1 蛋白质标记蛋白质标记 普通的普通的分子克隆技术分子克隆技术可以将这一段编可以将这一段编码蛋白质标记的基因片段导入目标蛋白编码蛋白质标记的基因片段导入目标蛋白编码基因的特定部位将带有标记基因的载码基因的特定部位将带有标记基因的载体导入感受态细胞，并通过体导入感受态细胞，并通过基因重组基因重组将内将内源性的目标蛋白基因置换为标记基因，其源性的目标蛋白基因置换为标记基因，其结果不仅可以在生理条件下得到标记蛋白结果不仅可以在生理条件下得到标记蛋白

8、及与之作用的蛋白质，而且标记蛋白的表及与之作用的蛋白质，而且标记蛋白的表达量与其在自然条件下的表达量相当，避达量与其在自然条件下的表达量相当，避免了由于过量表达导致非自然条件下的蛋免了由于过量表达导致非自然条件下的蛋白质相互作用。白质相互作用。1.2 构建表达标记蛋白的细胞或组织构建表达标记蛋白的细胞或组织 各种准备细胞抽提物的策略都可以应各种准备细胞抽提物的策略都可以应用于串联亲和纯化，但是有用于串联亲和纯化，但是有两点两点需要注意：需要注意：（1）各种不同的纯化策略都必须尽量保）各种不同的纯化策略都必须尽量保证能够降低非特异性相互作用的干扰，同证能够降低非特异性相互作用的干扰，同时尽可能不

9、要破坏自然存在的相互作用。时尽可能不要破坏自然存在的相互作用。（2）不同细胞器内的蛋白质有可能会因）不同细胞器内的蛋白质有可能会因为细胞破碎后混在一起，形成非自然的蛋为细胞破碎后混在一起，形成非自然的蛋白质降解，这种情况可以通过降低温度，白质降解，这种情况可以通过降低温度，缩短破碎时间，加入各种各样的蛋白酶抑缩短破碎时间，加入各种各样的蛋白酶抑制剂来避免。制剂来避免。1.3 细胞抽提物的准备细胞抽提物的准备 将细胞抽提物加入将细胞抽提物加入lgG亲和柱，标记蛋白一亲和柱，标记蛋白一端的端的ProtA结合区就会与亲和柱上的结合区就会与亲和柱上的IgG形成很形成很强的结合，即使用比较严谨的洗脱条件

10、，也不会强的结合，即使用比较严谨的洗脱条件，也不会使标记蛋白及与其作用的蛋白质所形成的蛋白质使标记蛋白及与其作用的蛋白质所形成的蛋白质复合体被洗脱下来。这样就降低了非特异性的蛋复合体被洗脱下来。这样就降低了非特异性的蛋白质相互作用，同时也保留了绝大部分自然存在白质相互作用，同时也保留了绝大部分自然存在的相互作用。然后用的相互作用。然后用TEv蛋白酶切割标签蛋白酶切割标签ProA，释放仍挂有，释放仍挂有CBP的蛋白复合物；在钙离子存在的蛋白复合物；在钙离子存在的情况下，将上面的纯化产物与钙调蛋白包被的的情况下，将上面的纯化产物与钙调蛋白包被的亲和珠一起孵育，通过亲和珠一起孵育，通过CBP亲和标签

11、复合物再次亲和标签复合物再次被纯化，最后在温和的条件下利用被纯化，最后在温和的条件下利用EGTA洗脱洗脱除去杂蛋白和除去杂蛋白和TEv蛋白酶剩余物。通过这样的两蛋白酶剩余物。通过这样的两步连续纯化就可得到高纯度的天然构象的蛋白步连续纯化就可得到高纯度的天然构象的蛋白(见图见图2)C93。1.4 串联亲和纯化串联亲和纯化(TAP)对通过串联亲和纯化得到的蛋白质复对通过串联亲和纯化得到的蛋白质复合体的鉴定有很多种方法，这里只举部分合体的鉴定有很多种方法，这里只举部分案例。案例。（1）可以将最后一步洗脱得到的复合物在）可以将最后一步洗脱得到的复合物在SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳一聚丙烯酰胺凝胶电泳(S

12、DSPAGE)或二维电泳上分离，然后用质谱或者蛋白或二维电泳上分离，然后用质谱或者蛋白质测序来鉴定复合体的各个组分。质测序来鉴定复合体的各个组分。（2）可以对蛋白质复合体进行体外活性测）可以对蛋白质复合体进行体外活性测定，以及通过电镜观察复合体结构等。定，以及通过电镜观察复合体结构等。1.5 蛋白质复合体的鉴定蛋白质复合体的鉴定 通过通过TAP技术最终可以发现细胞中新技术最终可以发现细胞中新的蛋白质复合体或者鉴定已发现复合体中的蛋白质复合体或者鉴定已发现复合体中新的组分新的组分TAP技术能够向我们提供大量技术能够向我们提供大量蛋白质复合体的信息，随着积累的蛋白质蛋白质复合体的信息，随着积累的蛋

13、白质复合体的数据增加，还可以建立蛋白质复复合体的数据增加，还可以建立蛋白质复合体相互作用的网络，建立这种网络的前合体相互作用的网络，建立这种网络的前提是认为含有共同组分的蛋白质复合体之提是认为含有共同组分的蛋白质复合体之间一定存在功能上的联系，而且研究者们间一定存在功能上的联系，而且研究者们越来越认为很多细胞功能是由蛋白质复合越来越认为很多细胞功能是由蛋白质复合体或者通过蛋白质复合体相互作用共同实体或者通过蛋白质复合体相互作用共同实现的，因此这种方法建立起来的蛋白质组现的，因此这种方法建立起来的蛋白质组水平上的相互作用网络图，能够代表细胞水平上的相互作用网络图，能够代表细胞各种生命行为的物质基

14、础。各种生命行为的物质基础。第一节第一节 TAP在蛋白质组学研究中的应用在蛋白质组学研究中的应用 2.1.1 在酵母蛋白质学中的应用在酵母蛋白质学中的应用 2.1.2 在大肠杆菌蛋白质学中的应用在大肠杆菌蛋白质学中的应用 2.1.3 在研究高等真核生物中蛋白相互作在研究高等真核生物中蛋白相互作 用的应用用的应用 2.1.4 在哺乳动物蛋白质学中的应用在哺乳动物蛋白质学中的应用 2.1.5 在植物蛋白质中应用在植物蛋白质中应用第二节第二节 TAP与其他技术联用与其他技术联用第二章第二章 TAP技术的应用技术的应用 1999年，年，Rigaut等将两个等将两个Protein A的的IgG结合单元结

15、合单元(Prot A与钙调蛋白结与钙调蛋白结合肽合肽(calmodulin binding peptide,CBP)相连，中间以烟草花叶病毒相连，中间以烟草花叶病毒(TMV)的特异性酶切位点相隔，这便的特异性酶切位点相隔，这便是最初的是最初的TAP 标签。标签。Rigaut利用该利用该标签成功地在酿酒酵母中纯化出了大标签成功地在酿酒酵母中纯化出了大量蛋白质复合体，也就此创立了串联量蛋白质复合体，也就此创立了串联亲和纯化技术。亲和纯化技术。短短十年之后，短短十年之后，TAP与质谱技术与质谱技术(mass spectrometry,MS)联用联用(TAP-MS)已成为一种已成为一种高效且实用的方法

16、在生物大分子相互作用领域高效且实用的方法在生物大分子相互作用领域中被广泛应用。近些年，随着中被广泛应用。近些年，随着TAP 标签的全标签的全面改进和质谱技术的不断发展，面改进和质谱技术的不断发展，TAPMS 的灵的灵敏度与专一性得到很大提高，使得该技术得以敏度与专一性得到很大提高，使得该技术得以在更多领域发挥重要作用，也使得我们对蛋白在更多领域发挥重要作用，也使得我们对蛋白质复合体进行系统性研究成为可能。质复合体进行系统性研究成为可能。随着该技术的不断成熟，随着该技术的不断成熟，TAP 技术迅速向各技术迅速向各个领域扩展。如今，个领域扩展。如今，TAP 已经在病毒、细菌、已经在病毒、细菌、原生

17、动物、植物以及哺乳动物等多个领域发挥原生动物、植物以及哺乳动物等多个领域发挥着积极作用。着积极作用。目前，目前，TAP技术与质谱技术的联用，以及技术与质谱技术的联用，以及质谱技术的自动化，使得大规模地分析相互质谱技术的自动化，使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上成为可能作用的蛋白质在技术上成为可能。这样。这样大规大规模、全细胞模、全细胞地分析蛋白质之间的相互作用可地分析蛋白质之间的相互作用可以向人们展示出细胞内蛋白质复合体之间的以向人们展示出细胞内蛋白质复合体之间的相互作用网络图相互作用网络图。这种相互作用的网络图是。这种相互作用的网络图是我们准确理解蛋白质功能，揭开各种细胞运我们准确理解

18、蛋白质功能，揭开各种细胞运营生命奥秘的又一重要信息平台。目前营生命奥秘的又一重要信息平台。目前TAP技技术虽然仅在下面几个方面得到了应用，但随术虽然仅在下面几个方面得到了应用，但随着该技术的不断发展完善，其应用的前景会着该技术的不断发展完善，其应用的前景会越来越广阔。越来越广阔。2.1 TAP在蛋白质组学研究中的应用在蛋白质组学研究中的应用 TAP技术首先是在芽殖和裂殖酵母技术首先是在芽殖和裂殖酵母中得到成功的应用，因为这种技术中得到成功的应用，因为这种技术不同于传统的蛋白标记技术，在酵不同于传统的蛋白标记技术，在酵母中可以通过同源重组达到快速、母中可以通过同源重组达到快速、大量的标记效果。大

19、量的标记效果。TAP技术较其他技术较其他蛋白质作用的研究方法优势在于：蛋白质作用的研究方法优势在于：可以鉴定出在空间上非直接物理相可以鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白分子。互作用的蛋白分子。2.1.1 在酵母蛋白质学中的应用在酵母蛋白质学中的应用Gavin等在酵母细胞中用等在酵母细胞中用TAP标签标记了标签标记了1739个个(约约14酵母蛋白酵母蛋白)编码基因，最后通编码基因，最后通过串联纯化得到过串联纯化得到589个标记的靶蛋白，并通过个标记的靶蛋白，并通过MALDITOF MS和生物学信息对其中的和生物学信息对其中的232个蛋白质复合体进行了鉴定分析。同时发现个蛋白质复合体进行了鉴定

20、分析。同时发现344种蛋白的新功能。种蛋白的新功能。Ybon等运用该技术分析发现了等运用该技术分析发现了AP C复合体复合体中有中有13个组分，而传统的遗传和生化技术只个组分，而传统的遗传和生化技术只鉴定出了鉴定出了11种组分。种组分。Bouveret等通过这种技术发现了一种新的类等通过这种技术发现了一种新的类Sm蛋白质复合体，这种复合体参与蛋白质复合体，这种复合体参与mRNA的的降解过程。降解过程。F0rler利用这一技术与利用这一技术与RNA干涉干涉技术结合研究酵母等较高级真核生物的蛋白技术结合研究酵母等较高级真核生物的蛋白质组功能。质组功能。2003年，年，Gully 等率先运用等率先运

21、用TAP对大肠杆菌酰对大肠杆菌酰基载体蛋白基载体蛋白(ACP)进行研究。进行研究。长期以来，大肠杆菌都是生命科学研究中最长期以来，大肠杆菌都是生命科学研究中最重要的模式生物之一，但有关大肠杆菌的系重要的模式生物之一，但有关大肠杆菌的系统蛋白质组研究却直到统蛋白质组研究却直到2005年才由年才由Butland等等进行了首次报道。进行了首次报道。他们的研究不仅证实了许多之前预测的蛋白他们的研究不仅证实了许多之前预测的蛋白质复合体，还发现了许多已知蛋白质间新的质复合体，还发现了许多已知蛋白质间新的相互作用，也让我们深入地了解了很多原核相互作用，也让我们深入地了解了很多原核生物生物保守蛋白质间的微观拓

22、扑结构保守蛋白质间的微观拓扑结构。2.1.2 在大肠杆菌蛋白质学中的应用在大肠杆菌蛋白质学中的应用 作为一种原核生物，大肠杆菌的结构作为一种原核生物，大肠杆菌的结构比真核生物简单，导入标签蛋白质的比真核生物简单，导入标签蛋白质的难度也要低于哺乳动物和酵母，且基难度也要低于哺乳动物和酵母，且基因易于操控。因易于操控。因此，因此，TAP技术在原核生物中应用时技术在原核生物中应用时选用亲和性较低的传统酵母选用亲和性较低的传统酵母TAP标签标签即可即可。因此，在目前有关大肠杆菌因此，在目前有关大肠杆菌T A P的报的报道中，基本都是沿用传统的酵母道中，基本都是沿用传统的酵母TAP标签标签(Rigaut

23、 实验中所使用的标签实验中所使用的标签)进进行研究，少有标签的改进。行研究，少有标签的改进。虽然虽然TAP技术能够对酵母细胞蛋白质的相互作技术能够对酵母细胞蛋白质的相互作用进行大规模地研究，但在高等真核细胞中用进行大规模地研究，但在高等真核细胞中的应用却受到的应用却受到限制限制，这是因为在高等真核细，这是因为在高等真核细胞中难以进行胞中难以进行原位蛋白标记原位蛋白标记，以及存在内源以及存在内源表达的蛋白质干扰，和蛋白质翻译后调控机表达的蛋白质干扰，和蛋白质翻译后调控机制的不同等因素。制的不同等因素。最近最近Forler等将等将TAP技术与技术与RNAi技术联用，技术联用，发现可以很大程度上降低

24、上述问题的影响。发现可以很大程度上降低上述问题的影响。目前这种联用的技术被称为目前这种联用的技术被称为iTAP，而且已经，而且已经在果蝇的在果蝇的s2细胞中得到了成功的应用。细胞中得到了成功的应用。2.1.3 在研究高等真核生物中蛋白相互作用的应用在研究高等真核生物中蛋白相互作用的应用 TAP技术被认为能广泛应用于系统绘制技术被认为能广泛应用于系统绘制各物种的蛋白质相互作用图谱。该技术各物种的蛋白质相互作用图谱。该技术目前在目前在绘制人类细胞系统全蛋白质相互绘制人类细胞系统全蛋白质相互作用图谱作用图谱中也发挥了很大作用。中也发挥了很大作用。除此之外，除此之外，TAP技术还被应用于研究复技术还被

25、应用于研究复杂的杂的生化反应路径及机制生化反应路径及机制，如人类转录，如人类转录机器的研究和鼠胚胎干细胞多能性的研机器的研究和鼠胚胎干细胞多能性的研究等。究等。2.1.4 在哺乳动物蛋白质学中的应用在哺乳动物蛋白质学中的应用 Bouwmeester 等在研究信号转导途径的过等在研究信号转导途径的过程中，为了探寻程中，为了探寻a-肿瘤坏死因子与核转录因肿瘤坏死因子与核转录因子的分子通路，标记了与该通路相关或疑似子的分子通路，标记了与该通路相关或疑似相关的相关的32 个蛋白质，采用个蛋白质，采用TAP-MS 技术，技术，成功鉴定出与该途径相关的成功鉴定出与该途径相关的221个蛋白质复个蛋白质复合体

26、，包括合体，包括80个从未发现的相互作用蛋白质个从未发现的相互作用蛋白质以及以及10个重要的功能分子。个重要的功能分子。Goldfinger 等在传统等在传统TAP 标签的基础上进标签的基础上进行优化，构造了新的行优化，构造了新的N端标签，建立了第一端标签，建立了第一个哺乳动物细胞内与个哺乳动物细胞内与Ras 相互作用的蛋白质相互作用的蛋白质数据库。数据库。TAP在植物中的应用目前还较有限，由于植在植物中的应用目前还较有限，由于植物蛋白质表达量较低，而适合植物使用的标物蛋白质表达量较低，而适合植物使用的标签还较少，所以纯化效率不高。目前大多数签还较少，所以纯化效率不高。目前大多数提纯方案采用传

27、统提纯方案采用传统TAP标签或标签或TAPi(improved TAP)标签。二者都已成功标签。二者都已成功应用于拟南芥和水稻蛋白质复合体的提纯。应用于拟南芥和水稻蛋白质复合体的提纯。另外，一种替代型另外，一种替代型TAP标标(alternative TAP tag,TAPa)也被报道，用于纯化拟南芥的蛋也被报道，用于纯化拟南芥的蛋白质复合体。白质复合体。2.1.5 在植物蛋白质中应用在植物蛋白质中应用 2008 年以来，有人开始运用新型年以来，有人开始运用新型GS-TAP 标签，即基于标签，即基于Prot G和链和链霉抗生物素蛋白结合肽霉抗生物素蛋白结合肽(streptavidinbindi

28、ng peptide,SBP)的的TAP标签对植物进行研究，标签对植物进行研究，取得了较好效果，显示出取得了较好效果，显示出TAP技术技术在植物蛋白复合物领域也具有一定在植物蛋白复合物领域也具有一定的应用潜力。的应用潜力。与其他技术联用，可发挥与其他技术联用，可发挥TAP的的更大潜能人们在逐步改善更大潜能人们在逐步改善TAP 技术技术自身缺陷的同时，还尝试将其与其自身缺陷的同时，还尝试将其与其它工具联合使用，这使它工具联合使用，这使TAP 在研究在研究蛋白质相互作用领域发挥着越来越蛋白质相互作用领域发挥着越来越重要的作用。重要的作用。2.2 TAP与其他技术联用与其他技术联用Lavoie等采用

29、的实验方法能够基于等采用的实验方法能够基于TAP、HA、MYC标签进行标签进行PCR介导的同源重组。标签标介导的同源重组。标签标记蛋白质可以被用来进行记蛋白质可以被用来进行串联亲和纯化串联亲和纯化或或染染色质免疫沉淀色质免疫沉淀和和基因芯片分析基因芯片分析。Kobayashi等设计了一种新型标签，将八聚等设计了一种新型标签，将八聚组氨酸组氨酸(8His)、链霉素结合肽、链霉素结合肽(SBP)和和C 端端Myc 标签串联到绿色荧光蛋白标签串联到绿色荧光蛋白(GFP)的一个的一个环里，使得这个新型标签具有蛋白质定位和环里，使得这个新型标签具有蛋白质定位和蛋白质纯化蛋白质纯化双重作用双重作用。这种。

30、这种TAP 与免疫荧光与免疫荧光技术相结合的设计为我们更深入了解蛋白质技术相结合的设计为我们更深入了解蛋白质的内部信息提供了方便。的内部信息提供了方便。第一节第一节 标签系统的改进标签系统的改进 3.1.1 N末端末端TAP标签标签 3.1.2 分离式标签分离式标签 3.1.3 差减式标签差减式标签 第二节第二节 纯化方法的改进纯化方法的改进 第三章第三章 TAP技术改进技术改进 最初人们广泛采用上述的最初人们广泛采用上述的C末端末端TAP标签，标签，后来，随着研究的深入，研究者，后来，随着研究的深入，研究者，发现发现C末端多肽的引入会严重损害一些目的蛋白末端多肽的引入会严重损害一些目的蛋白的

31、功能的功能,产生生长缺陷甚至死亡，产生生长缺陷甚至死亡，并将融并将融合蛋白载体平行导入单倍体和二倍体细胞合蛋白载体平行导入单倍体和二倍体细胞加以验证，仍不能解决以上问题。加以验证，仍不能解决以上问题。3.1.1 N末端末端TAP标签标签 3.1 标签系统的改进标签系统的改进为了处理上述问题，为了处理上述问题，Puig等发展了等发展了N末端末端 T A P标签，如标签，如图图3所示所示.N末端末端T AP标签具有标签具有与与C末端末端TAP标签相同的模体，但模体顺序标签相同的模体，但模体顺序却是相反的。为了使却是相反的。为了使 Prot A模体模体 在第一步在第一步纯化中便于切除，纯化中便于切除

32、，N端端TAP标签基因后紧接标签基因后紧接靶基因，同时，在靶基因，同时，在N末端末端 T A P标签的标签的CBP模体后加入一肠激酶模体后加入一肠激酶(E K)切位点切位点，便于，便于从融合蛋白中去除标签残基。从融合蛋白中去除标签残基。当不同复合物的两个亚基存在协同作用并可形成一个新当不同复合物的两个亚基存在协同作用并可形成一个新的复合物时，由于其相互作用的部分较小，大部分亚基的复合物时，由于其相互作用的部分较小，大部分亚基仍保持游离状态或两个亚基主要是与其他复合物蛋白紧仍保持游离状态或两个亚基主要是与其他复合物蛋白紧密结合。密结合。用分离式标签可将这一含量稀少的特定复合物分离出来。用分离式标

33、签可将这一含量稀少的特定复合物分离出来。它的策略是将它的策略是将 TAP标签的模体分开，分别融合于两个亚标签的模体分开，分别融合于两个亚基即一个亚基同基即一个亚基同 P rotA与与TEV模体融合，而另一个与模体融合，而另一个与 C B P融合。如融合。如图图4所示，第一次亲和纯化时，仅包括所示，第一次亲和纯化时，仅包括 CBP模体的非特定复合物因不能结合模体的非特定复合物因不能结合 I gG珠而被除去，珠而被除去，经经 1 EV蛋白酶处理后，再进行第二次纯蛋白酶处理后，再进行第二次纯 化时，只有当化时，只有当两个靶亚基相互作用形成复合物后，才能结合于亲和柱两个靶亚基相互作用形成复合物后，才能

34、结合于亲和柱上并被分离。上并被分离。3.1.2 分离式标签分离式标签 当两个复合物共有一个相同的亚基时，而其当两个复合物共有一个相同的亚基时，而其中仅有一个复合物是我们所需要的，直接分中仅有一个复合物是我们所需要的，直接分离会发生共分离现象。离会发生共分离现象。为了分离这一复合物。可用差减式标签策略。为了分离这一复合物。可用差减式标签策略。如如图图5即将两种复合物的共同亚基都与普通即将两种复合物的共同亚基都与普通 T A P标签融合，而非必需复合物的另一蛋白标签融合，而非必需复合物的另一蛋白与一个单与一个单P rotA模体标签模体标签(无无TEV切点切点)融合。融合。这样，当第一次亲和纯化后，

35、非必需复合物这样，当第一次亲和纯化后，非必需复合物因仍结合于因仍结合于 I g G珠而不被洗脱，必需复合物珠而不被洗脱，必需复合物即可在第二次亲和纯化中获得。即可在第二次亲和纯化中获得。3.1.3 差减式标签差减式标签 另外，在具体纯化步骤上，还可采用另外，在具体纯化步骤上，还可采用省略透省略透析，加入非离子去垢剂，提高盐浓度析，加入非离子去垢剂，提高盐浓度等手段等手段，以提高表达蛋白溶解度。准备细胞抽提物，以提高表达蛋白溶解度。准备细胞抽提物时，为了排除降解的可能性，可采用时，为了排除降解的可能性，可采用 Western印迹技术以检测融合蛋白的印迹技术以检测融合蛋白的ProtA部部分，从而确

36、定抽提的效果及分，从而确定抽提的效果及TAP标签的稳定性。标签的稳定性。总之，与质谱连用的总之，与质谱连用的TAP技术是我们研究蛋质技术是我们研究蛋质组学的有力工具，必将在解析生物蛋白复合组学的有力工具，必将在解析生物蛋白复合体功能方面发挥重要作用。体功能方面发挥重要作用。3.2 纯化方法的改进纯化方法的改进 随着随着TAP技术自身的技术自身的发展以及与其他技术发展以及与其他技术联用之后所联用之后所 发挥出的发挥出的巨大生命力。巨大生命力。TAP技术技术在研究蛋白质相互作在研究蛋白质相互作用的各个方面都比传用的各个方面都比传统方法有所突破。统方法有所突破。第四章第四章 存在的问题存在的问题但但

37、TAP技术与其他标签融合方法技术与其他标签融合方法一样具局限性。一样具局限性。TAP标签的引入标签的引入可能会影响靶蛋白和亲和柱的结可能会影响靶蛋白和亲和柱的结合，影响蛋白的表达；少数靶蛋合，影响蛋白的表达；少数靶蛋白会在白会在TEv蛋白酶处理过程中被破蛋白酶处理过程中被破坏；细胞裂解过程有时会影响坏；细胞裂解过程有时会影响TAP标签表达；有时由于细胞内标签表达；有时由于细胞内源钙调蛋白与源钙调蛋白与 CBP模体的结合，模体的结合，影响第二次的纯化。另外纯化中影响第二次的纯化。另外纯化中 EGTA或其他溶剂的使用会干扰复或其他溶剂的使用会干扰复合合 物的完整性和活性过程。为此物的完整性和活性过

38、程。为此人们对它做了一系列的改进。人们对它做了一系列的改进。关关键键词词：串串联联亲亲和和纯纯化化关关键键词词：蛋蛋白白质质相相互互作作用用 了解蛋白的功能了解蛋白的功能是生物学研究的是生物学研究的一项主要任务，一项主要任务，TAP对于分离、对于分离、鉴定蛋白的相互鉴定蛋白的相互作用分子式一种作用分子式一种十分有用的技术。十分有用的技术。结束语结束语关关键键词词：蛋蛋白白质质组组学学 关关键键词词：蛋蛋白白质质相相互互作作用用将来，从将来，从PCR、克隆挑选、克隆挑选、组织细胞培养，到蛋白质纯组织细胞培养，到蛋白质纯化、质谱分析，化、质谱分析，TA P 技术技术的每个步骤都可逐步实现自的每个步

39、骤都可逐步实现自动化，这势必将大大提高解动化，这势必将大大提高解析蛋白复合体和蛋白相互作析蛋白复合体和蛋白相互作用网格的熟读和能力，与其用网格的熟读和能力，与其他研究蛋白相互作用的方法他研究蛋白相互作用的方法相结合，应用于大规模的功相结合，应用于大规模的功能蛋白质组学研究，从而更能蛋白质组学研究，从而更全面客观地了解形形色色的全面客观地了解形形色色的细胞事件。细胞事件。尽管尽管 TAP技术存在一些局技术存在一些局限性，限性，但但TAP技术具有鉴技术具有鉴定在生理条件下所有相互作定在生理条件下所有相互作用蛋白质的能力；假阳性和用蛋白质的能力；假阳性和假阴性假阴性 水平低；具备通用水平低；具备通用

40、性以及自动化等优势；与质性以及自动化等优势；与质谱等其他技术联谱等其他技术联 用。用。能大能大规模地研究细胞内蛋白质分规模地研究细胞内蛋白质分子之间的相互作用网络。因子之间的相互作用网络。因此，此，T A P 技术在研究蛋白技术在研究蛋白质相互作用过程中必将发挥质相互作用过程中必将发挥越来越重要的作用。越来越重要的作用。关关键键词词：网网络络图图组员表组员表演讲者：演讲者：杜寿辉、李文茂杜寿辉、李文茂综述作者：综述作者：苏凌燕、何素瑞、赵佐斯、苏凌燕、何素瑞、赵佐斯、豆金仙、李鑫豆金仙、李鑫PPT制作：制作：程晨程晨 资料收集者：王赛男资料收集者：王赛男问题回答者：李宝鑫、李文茂、杜寿辉问题回答者：李宝鑫、李文茂、杜寿辉