6.分子病理学1.ppt
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1、分子病理学常用研究方法分子病理学常用研究方法(一一)基因变异的诊断基因变异的诊断Southernblot,PCR,RT-PCR,Real-TimeRT-PCR,FISH分子遗传学异常检测方法分子遗传学异常检测方法检测基因的丢失和扩增检测基因的丢失和扩增比较基因组杂交比较基因组杂交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合优点:优点:1.新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可进行进行CGH研究研究2.被测样品只需数被测样品只需数m mg甚至不到甚至不到1m m
2、g的的DNACGH的应用:的应用:1.为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围肿瘤细胞染色体某一位置上肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增序列拷贝数增加,往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基加,往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有扩增因有扩增肿瘤细胞染色体某一位置上肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数减序列拷贝数减少或缺失,提示该位置可能包含已知或未知的抑少或缺失,提示该位置可能包含已知或未知的抑癌基因丢失癌基因丢失CGH发现发现MYCN,MET与与胃癌相关胃癌相关2.区分良恶性病变,临床上估计预后区分良恶性病变,临床上估计预后3.4.16例前
3、列腺癌例前列腺癌CGH显示染色体异常占显示染色体异常占81%5.5例良性前列腺增生全部阴性例良性前列腺增生全部阴性 67肝细胞癌肝细胞癌CGH显示显示:1q,8q,20q,17q4q,8p,13q,16q12例癌周肝硬化组织:阴性例癌周肝硬化组织:阴性53例淋巴结阴性乳腺癌:例淋巴结阴性乳腺癌:8q,11q13,17q,20q异常,预后差异常,预后差蛋白组学及生物芯片蛋白组学及生物芯片生物芯片(生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸片段(寡核苷酸、核酸片段(寡核苷酸、cDNA、基因组基因组DNA、RNA)或多肽分子甚至
4、细胞等生物样品有序地固或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼定于支持物(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面,组成密集的二维分子排列,龙膜等载体)的表面,组成密集的二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量改变。改变。生物芯片:生物芯片:基
5、因芯片基因芯片蛋白质芯片蛋白质芯片细胞芯片细胞芯片组织芯片组织芯片基因芯片基因芯片(Affymetrix专利)专利)寡核苷酸芯片,寡核苷酸芯片,cDNA芯片,基因组芯片芯片,基因组芯片DNAmicroarray:阵密度很高的玻片基质或胶膜基质阵密度很高的玻片基质或胶膜基质的的DNA微阵列微阵列DNAmacroarray:阵密度较低的尼龙膜阵密度较低的尼龙膜DNA微阵列微阵列杂交组织化学杂交组织化学-概述概述一、概述和原理一、概述和原理杂交组织杂交组织/细胞化学细胞化学(Hybridohistochemistry)原位分子杂交原位分子杂交(Insituhybridization,ISH)运用核酸
6、分子间硷基互补的性质结合免疫组织化运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化学技术在组织切片学技术在组织切片(或细胞片或细胞片)上显示特异核酸上显示特异核酸(DNA或或RNA)序列的一种技术。序列的一种技术。杂交组织化学原理杂交组织化学原理标记探针杂交变性 标记探针 互补核酸顺序 DNA/cDNA DNA DNA/cDNA RNA RNA RNA核酸分子杂交种类:核酸分子杂交种类:固相杂交固相杂交(硝酸纤维素膜或尼龙膜硝酸纤维素膜或尼龙膜)Southern印迹转移印迹转移(DNA)Northern印迹转移印迹转移(RNA)液相杂交液相杂交原位杂交原位杂交原位杂交四要素:原位杂交四要素:适当的探
7、针适当的探针良好的组织材料良好的组织材料可靠的试剂和方法可靠的试剂和方法相当的形态学基础相当的形态学基础二、探针的制备二、探针的制备1.探针的种类和制备探针的种类和制备DNA探针探针:应用多,操作容易:应用多,操作容易比较敏感,背景高比较敏感,背景高(自身网络自身网络)双链双链DNA探针用时要变性探针用时要变性整合整合转化转化扩增扩增DNA片段片段质粒质粒(或其他载体或其他载体)细菌细菌提取提取酶切酶切质粒质粒探针探针(PCR扩增扩增)线性质粒 提取质粒扩增 探针重组质粒 质粒酶切插入 转染 探针RNA探针探针:结合稳定,穿透性好:结合稳定,穿透性好无需变性,不存在退火问题无需变性,不存在退火
8、问题未杂交探针可用未杂交探针可用RNase去除,背景好去除,背景好多采用体外转录法合成同时加以标记多采用体外转录法合成同时加以标记寡核苷酸探针寡核苷酸探针:合成快速,不用变性,对:合成快速,不用变性,对RNase不敏感不敏感30-150bp,组织通透性好组织通透性好未端标记,敏感度不够未端标记,敏感度不够多采用多采用DNA合成仪固相合成合成仪固相合成探针的选择探针的选择:特异性特异性多选择基因组的多选择基因组的5或或3端端20-50对碱基互补就已稳定对碱基互补就已稳定大大小小200-300对碱基互补可获强的复合体对碱基互补可获强的复合体原位杂交多选择原位杂交多选择100-400bp(DNA-R
9、NADNA-DNA2.探针的标记探针的标记标记物标记物:同位素:同位素,非同位素非同位素,修饰物修饰物同位素:同位素:敏感,定位较差,实验室要求高敏感,定位较差,实验室要求高探针使用周期短探针使用周期短32P放射过强放射过强,定位差定位差,半衰期短半衰期短(14.3天天)35S最常用最常用,定位好定位好,曝光时间短曝光时间短(数天数天),半衰期较长半衰期较长(84天天)125I与与35S相似,但半衰期较短相似,但半衰期较短(60天天)3H常用常用,放射能小放射能小,定位准确定位准确,曝光时间长曝光时间长(数周数周),半衰期长半衰期长非同位素:非同位素:定位较好,实验室要求低,可长期使用定位较好
10、,实验室要求低,可长期使用生物素生物素:最早用,特点与免疫组化相似:最早用,特点与免疫组化相似地高辛地高辛:最常用,敏感性高,特异性好:最常用,敏感性高,特异性好荧光素荧光素:方法简便,敏感性低,多用于染色体检查:方法简便,敏感性低,多用于染色体检查修饰物修饰物(现少用现少用):磺基化:磺基化(Sulphon基团基团)乙酰氨基芴乙酰氨基芴光敏生物素光敏生物素汞汞标记方法标记方法引入法:引入法:运用标记好的核苷酸合成探针运用标记好的核苷酸合成探针缺口翻译法缺口翻译法随机引物法随机引物法末端标记法末端标记法PCR扩增标记法扩增标记法RNA体外合成法体外合成法化学修饰法:化学修饰法:化学修饰已合成的
11、探针化学修饰已合成的探针缺口翻译缺口翻译/平移法:平移法:双链双链DNA标记,线环状均可标记,线环状均可分子较大分子较大(1KB)者效果好者效果好DNA用量较多用量较多(200ng)标记率低标记率低原理:原理:DNA酶酶(DNaseI)在双链在双链DNA分子中导入缺口分子中导入缺口DNA聚合酶聚合酶(DNApolI,具有具有53外切酶和外切酶和53聚合酶活性聚合酶活性),使各种核苷酸,使各种核苷酸,包括包括标记核苷酸自缺口处合成与对应链互补的标记核苷酸自缺口处合成与对应链互补的DNA链链(探针探针)变性后标记探针分子小,穿透性好变性后标记探针分子小,穿透性好缺口翻译/平移法随机引物法:随机引物
12、法:单单/双链线状双链线状DNA标记,标记,100-500bp亦可亦可DNA用量少用量少(可少至可少至10ng)标记率高标记率高(1/20-25)原理:以任意顺序的六核苷酸片段为引物与单链原理:以任意顺序的六核苷酸片段为引物与单链DNA模板结合后,在模板结合后,在DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段片段(无无5-3外切酶活性外切酶活性)作用下合成带标记核苷酸作用下合成带标记核苷酸的互补的互补DNA链链(探针探针)随机引物法1.于于Eppendorf离心管中依次加入离心管中依次加入15lddH2O1gDNA(10ng-3g)10010(变性变性)干冰聚冷干冰聚冷30秒钟秒钟2.加入加入10六
13、核苷酸混合物六核苷酸混合物2l10dTNP标记混合液标记混合液2l含含1mMdATP,1mMdCTP,1mMdGTP,0.65mMdTTP,0.35mMDIG-dUTPKlenow酶酶(2U/l)1l3.混合后混合后37保温保温1-2h(可达可达20h)4.加入加入2lpH8.0200mMEDTA终止反应终止反应5.加入加入2l糖原糖原(10mg/ml)6.加加2.5l4MLiCl或或3MNaAc(pH5.5)7.加加75l无水乙醇无水乙醇(-20预冷预冷)8.混合后混合后-70309.13000g4离心离心15,弃上清,弃上清10.加加100l70%乙醇乙醇(预冷预冷)洗,离心弃上清洗,离心
14、弃上清11.真空干燥,加真空干燥,加50lTE(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)溶解,溶解,-20保存保存末端标记法:末端标记法:用于短链用于短链DNA或寡核苷酸探针标记或寡核苷酸探针标记敏感性较低敏感性较低40个以上碱基检测较稳定个以上碱基检测较稳定又分又分3端标记法和端标记法和5端标记法端标记法3端标记法:端标记法:原理:原理:DIG-11-ddUTP在末端脱氧核苷酸转移酶作用在末端脱氧核苷酸转移酶作用下与寡核苷酸的下与寡核苷酸的3端相连端相连5端标记法:端标记法:原理原理:在碱性磷酸酶的作用下把在碱性磷酸酶的作用下把5端磷酸脱去端磷酸脱去,T4噬菌体多核噬菌体多核苷
15、酸激酶将苷酸激酶将-32PATP的的-32P转移到转移到5端端PCR扩增标记法:扩增标记法:用于用于cDNA的合成和标记,方法简单的合成和标记,方法简单DNA用量少,产量多用量少,产量多原理:原理:TaqDNA多聚酶以多聚酶以DNA为模板,在引物引导下为模板,在引物引导下合成带有标记核苷酸的合成带有标记核苷酸的cDNA探针。探针。PCR扩增标记法1.于于Eppendorf离心管中加入离心管中加入10PCR缓冲液缓冲液5l(1)MgCl2210l(15mM)引物引物适量适量(0.11M)标记标记/非标记非标记dNTP5l(200M,dTTP:Dig-dUTP=3:1)ddH2O加到加到50l模板
16、模板DNA1100ngTagDNA多聚酶多聚酶0.21l(15units)反应组反应组对照组对照组1对照组对照组2DNA模板模板+-Dig-dUTP+-2混合后混合后PCR仪扩增仪扩增循环循环温度温度时间时间194C594C45231550.2C4572C903272C5334CHold3.纯化和鉴定纯化和鉴定乙醇沉淀法:乙醇沉淀法:100lPCR产物加产物加10l4MLiCl和300l预冷的预冷的100%乙醇乙醇,-20C,2小时,离心小时,离心4C13000g,5分钟分钟Agarose凝胶电泳凝胶电泳RNA体外合成体外合成/标记法:标记法:用以合成并同时标记用以合成并同时标记RNA探针探针
17、产量高,产量高,NTP浓度要求低,浓度要求低,不用纯化不用纯化原理:将模板原理:将模板DNA(双链双链)插入带有噬菌体插入带有噬菌体RNApol启动子的特定质粒,在体外启动子的特定质粒,在体外RNApol作用下,作用下,以以DNA为模板、启动子为起点,为模板、启动子为起点,合成带有标合成带有标记核苷酸的记核苷酸的RNA探针。探针。杂交组织化学 RNA体外合成/标记法pGEM1.于于Eppendorf离心管中加入离心管中加入DNA模板模板(酶切成线性酶切成线性)1g含噬菌体启动子的质粒含噬菌体启动子的质粒NTP标记混合物标记混合物2l含含10mMATP,10mMCTP10mMGTP,6.5mMU
18、TP3.5mMDIG-11-UTP10反应缓冲液反应缓冲液2lDEPC处理的处理的H2O加至加至17l2.混合后加:混合后加:RNase抑制剂抑制剂1lRNA多聚酶多聚酶(SP6/T7)2l3.柔和混合后柔和混合后37保温保温2h4.加入加入DNase2l,3715(去除模板去除模板DNA)5.加入加入2l200mMpH8.0EDTA6.加入加入2.5l4MLiCl和和75l预冷乙醇预冷乙醇7.混合后置混合后置-70,30或或-20过夜过夜8.413000g离心离心15,弃上清,弃上清9.加加100l70%乙醇乙醇(预冷预冷)洗,离心弃上清洗,离心弃上清10.真空干燥,加真空干燥,加100lD
19、EPC-H2O溶解,溶解,-20保存保存化学修饰法:化学修饰法:常用的有光敏生物素、磺化常用的有光敏生物素、磺化可用以标记单可用以标记单/双双链链DNA或或RNA光敏生物素标记:光敏生物素光敏生物素标记:光敏生物素+核酸核酸标记探针标记探针磺化标记:亚硫酸氢钠和甲基羟胺使胞嘧啶的磺化标记:亚硫酸氢钠和甲基羟胺使胞嘧啶的C5磺化,磺化,生成生成Sulphon基团。基团。乙酰氨基芴乙酰氨基芴(AAF)标记:标记:N-acetoxy-AAF与探针一起孵育时,与探针一起孵育时,AAF基团与鸟嘌呤核苷残基共价结合基团与鸟嘌呤核苷残基共价结合3.标记探针的纯化标记探针的纯化目的:目的:去除无机盐、去除无机
20、盐、dNTP、酶等酶等方法:方法:沉淀离心法沉淀离心法加入加入EDTA中止反应,再加中止反应,再加4MLiCl和乙醇冷冻离心,和乙醇冷冻离心,乙醇洗涤,干燥后用缓冲液溶解乙醇洗涤,干燥后用缓冲液溶解玻璃纤维滤过法玻璃纤维滤过法反应物与玻璃纤维结合,清洗,缓冲液洗脱反应物与玻璃纤维结合,清洗,缓冲液洗脱4.标记结果的检验标记结果的检验目的:目的:证实标记结果;估计探针得率;测试检测条件证实标记结果;估计探针得率;测试检测条件非同位素标记探针的检验:采用斑点印迹法非同位素标记探针的检验:采用斑点印迹法不同浓度不同浓度(10倍梯度稀释倍梯度稀释)的标记探针点尼龙膜的标记探针点尼龙膜常规检测系统显色常
21、规检测系统显色未标记探针点膜后用标记探针杂交未标记探针点膜后用标记探针杂交不同浓度(不同浓度(10倍梯度稀释)的标记探针点尼龙膜倍梯度稀释)的标记探针点尼龙膜DNARNA探针:探针:0.01pg1ngul寡核苷酸探针:寡核苷酸探针:0.08FM50fM/ul紫外照光或加热紫外照光或加热12030固膜固膜缓冲液缓冲液1洗膜(洗膜(100mM马来酸,马来酸,150mMNaC1,pH7.5)缓冲液缓冲液2(1%阻断剂,缓冲液阻断剂,缓冲液1配)配)30抗抗DIG一碱性磷酸酶一碱性磷酸酶1:5000,孵育,孵育30缓冲液缓冲液1洗膜洗膜缓冲液缓冲液3浸浸2(100mMTris-HC1100mMNaC1
22、,50mMMgC12,pH9.5)显色液(显色液(NBT:BCIP,9:7),),作用作用0.516h缓冲液缓冲液3洗膜洗膜三、组织处理和标本制作三、组织处理和标本制作目的:目的:保留好被测核酸保留好被测核酸维持形态结构维持形态结构方法:方法:新鲜取材、及时固定新鲜取材、及时固定适当的固定液:适当的固定液:4%多聚甲醛多聚甲醛(用用0.1MPB配制配制)用于:用于:冰冻或石蜡切片冰冻或石蜡切片细胞培养片、细胞涂片或切片细胞培养片、细胞涂片或切片DNA稳定性好,一般不需特殊处理稳定性好,一般不需特殊处理RNA酶酶的灭活的灭活(杂交前杂交前):组织内的组织内的Rnase:固定剂灭活固定剂灭活玻璃器
23、皿:玻璃器皿:180处理处理3h以上以上用用DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐)水处理水处理试剂:用试剂:用DEPC水配制和水配制和/或高压消毒或高压消毒带手套操作带手套操作RNase抑制剂抑制剂检测检测RNA时标本制备及玻片处理常规:时标本制备及玻片处理常规:切片处理:切片处理:切片插架切片插架热水稀释的中性洗涤剂浸泡热水稀释的中性洗涤剂浸泡30流水冲洗流水冲洗高压消毒高压消毒流水冲洗流水冲洗蒸馏水洗蒸馏水洗1803hAPES处理处理(2%APES/甲醇)室温甲醇)室温1,甲醇洗,甲醇洗DEPC水洗水洗阴干阴干标本处理:标本处理:4%多聚甲醛多聚甲醛(PB配配)4过夜过夜乙醇脱水乙醇脱水
24、二甲苯透明二甲苯透明石蜡包埋石蜡包埋切片切片DEPC水:水:0.1DEPC,室温放置室温放置3h,高压消毒高压消毒四、原位分子杂交四、原位分子杂交要求:要求:提高敏感性提高敏感性降低非特异着色降低非特异着色方法:方法:去垢剂去垢剂(TritonX-100):增强组织通透性增强组织通透性蛋白酶蛋白酶(蛋白酶蛋白酶K)消化:消化:增加通透性、去除杂蛋白增加通透性、去除杂蛋白稀酸:稀酸:杂蛋白变性、去内源性酶、暴露靶核酸杂蛋白变性、去内源性酶、暴露靶核酸乙酰化处理:乙酰化处理:中和阳离子,减少静电吸引中和阳离子,减少静电吸引适当的杂交条件:适当的杂交条件:温度、离子强度、温度、离子强度、pH探针的种
25、类、大小、浓度探针的种类、大小、浓度杂交液:杂交液:葡聚糖:增加探针相对浓度葡聚糖:增加探针相对浓度鱼精鱼精DNA、tRNA的应用:封闭的应用:封闭充分洗涤充分洗涤1.杂交前处理杂交前处理石蜡切片常规石蜡切片常规脱蜡脱蜡,PB洗片,洗片,TritoX-100蛋白酶蛋白酶K消化消化,37,(115g/ml,15120)4%多聚甲醛多聚甲醛后固定后固定,室温,室温10PB洗片洗片122;0.2MHCl,室温室温10;PB洗片洗片1220.1M三乙醇胺三乙醇胺(DEPC-H2O配配),室温,室温23三乙醇胺三乙醇胺/无水无水乙酸乙酸室温室温10PB洗片,室温洗片,室温2270%80%90%100%1
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- 分子病 理学
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