PCR(生物化学).ppt

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1、聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)根据细胞分裂中根据细胞分裂中 DNA 半保留复制半保留复制机理，在体外快速扩增某一特定机理，在体外快速扩增某一特定 DNA 片段的方法。片段的方法。PCRPCR工作原理工作原理以要扩增的要扩增的DNADNA分子为分子为模板模板，以一对与模板一对与模板55末端和末端和33末端互补的寡核甘末端互补的寡核甘酸片段为酸片段为引物引物4 4种种脱氧核糖核甘酸脱氧核糖核甘酸存在的条件下存在的条件下依赖依赖DNADNA聚合酶聚合酶的的酶促合成酶促合成反应反应。PCR PCR特异性特异性取决于取决于引物引物和模板和模板DNADN

2、A结结合特异性合特异性。体外体外(试试管中管中)扩扩增特异增特异DNADNA片段片段短短时时间间内即可将所需内即可将所需目的目的DNADNA片段片段扩扩增增至至100100万万倍以上倍以上PCRPCR技术技术 特点特点 敏感度高、特异性强、产率高、敏感度高、特异性强、产率高、重复性好、操作简便、快速重复性好、操作简便、快速 PCRPCR体系基本组成体系基本组成模板模板DNADNA：（10102-52-5）拷贝拷贝dNTPdNTP底物：底物：2020020200umolumol/L/L特异性特异性引物：引物：0.10.5 0.10.5 umolumol/L/LDNADNA聚合酶：聚合酶：Klen

3、owKlenow T4 T4、T7 T7聚合酶聚合酶 TaqDNATaqDNA聚聚合合酶酶:耐耐热热稳稳定定性性、5-35-3聚聚合合酶酶活活性性及及3-53-5外切酶活性，可外切酶活性，可校正校正PCRPCR反应中某些单核甘酸的反应中某些单核甘酸的错配错配。含含MgMg2+2+的缓冲液：的缓冲液：Mg Mg2+2+能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.52.01.52.0mmolmmol/L/L，过量将增加非特异性条带的产生。过量将增加非特异性条带的产生。循环次数取决于模板DNA的浓度30次扩增100万倍反应分反应分三步三步：1 变性变性 den

4、aturationdenaturation：加热加热90-9590-95，模板，模板DNADNA双链解离形成双链解离形成单链单链DNADNA；2 2 退火退火 anneallingannealling：温度突然降低温度突然降低,引物与模板引物与模板DNADNA结合结合,40-6040-60,TmTm值值 4 4（G+CG+C）+2+2（A+TA+T）-5.-5.3 3 延伸延伸 extensionextension：TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶以以4 4dNTPdNTP为底物，在为底物，在MgMg2+2+存在存在 的条件下，的条件下，催化催化DNADNA合成合成。70-7570-75时

5、间时间-要扩增片段长度决定要扩增片段长度决定1.长度：长度：15-30 个核苷酸；个核苷酸；2.避免嘌呤、嘧啶堆积，避免嘌呤、嘧啶堆积，GC ：40-60；引物设计的原则引物设计的原则Tm=69.3+0.41(G+C%)引物长度引物长度为为 18-24 个碱基个碱基：Tm(C)4(GC)2(AT)5 ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG 3 GC 12；AT 8Tm 4 X 12 2 X 8 64 C3.四种碱基随机分布；四种碱基随机分布；4.引物自身不应存在互补序列，以防引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构；形成发夹结构；引物设计的原则引物设计的原则5 GTTGACTTGATA T

6、 3 GAACTCT5 GTTGACTTGATATTCTCAAG 3 引物的自身互补序列形成引物的自身互补序列形成发夹结构发夹结构5 ACCGGTAGCCACGAATTCGT 3 3 TGCTTAAGCACCGATGGCCA 55 ACCGGTAGCCACGAATTCGT 3 两个引物分子形成二聚体两个引物分子形成二聚体5.引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体(dimer)；引物设计软件：引物设计软件：Primer 3,Oligo引物设计的原则引物设计的原则6.引物引物3末端碱基原则上与模板配对，末端碱基原则上与模板配对，引物的引物的 5 端端可以游

7、可以游离离,可添加限制性内切酶识别位点，便于可添加限制性内切酶识别位点，便于PCR 产物的定向产物的定向克隆。克隆。引物设计的原则引物设计的原则5 CATATG33TTCGAA 5NdeIHindIII待扩增片段：待扩增片段：1000 bp引物引物 Tm 55DNA 模板变性模板变性:94,5分钟分钟;PCR 循环循环(30 次次):94,30秒秒;50,30秒秒;72,1分钟分钟;最终延伸最终延伸:72,7-10分钟分钟PCR 反应条件的设定反应条件的设定 PCRPCR产物的检测产物的检测 琼脂糖凝胶电泳；琼脂糖凝胶电泳；（EBEB）分子杂交；分子杂交；限制性内切酶酶切分析；限制性内切酶酶切

8、分析；微孔板夹心杂交法；微孔板夹心杂交法；直接测序直接测序PCR 产物的检测产物的检测-琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR 产物产物PCR 产物产物PCR 技术的应用技术的应用1.基础研究基础研究(1)基因或基因或 cDNA 克隆克隆：从基因数据库中获得某一基因或：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 的核的核 苷酸序列，用苷酸序列，用 PCR 方法扩增并克隆该基因或方法扩增并克隆该基因或 cDNA。(2)基因表达：基因表达：用用 RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达检测某一特定基因在转录水平的表达。2.医学医学(1)感染性疾病感染性疾病病原体的诊断：病原体的诊断：HIV、结核分枝杆

9、菌、乙肝病毒等。结核分枝杆菌、乙肝病毒等。(2)遗传病相关基因遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。(3)恶性肿瘤的诊断恶性肿瘤的诊断3.基因动、植物的检测基因动、植物的检测(1)转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。(2)转基因植物的检测：玉米、大豆等。转基因植物的检测：玉米、大豆等。PCR新技术RT-PCRRT-PCR：用于用于RNARNA分析分析PCR-SSCPPCR-SSCP：可用于可用于点突变分析点突变分析热启动热启动PCRPCR：可提高特异性。：可提高特异性。不对称不对称PCRPCR（asym

10、metricasymmetric PCR PCR）多重多重PCR(multiplexPCR(multiplex PCR)PCR)巢式巢式PCR(nestedPCR(nested PCR)PCR)实时定量实时定量 PCR(Real Time Quantitative PCR,qRT-PCR)反转录反转录 PCR(RT-PCR)RT-PCR 将以将以 RNA 为模板的为模板的 cDNA 合成合成同同 PCR 结合结合在一起，提在一起，提供了一种供了一种分析基因表达分析基因表达的快速灵敏的的快速灵敏的方法。方法。53AAAAA535335533553RT-PCR 原理原理mRNA1st cDNA逆转

11、录酶、逆转录酶、下游引物、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶、上游及下游引物、上游及下游引物、dNTPs5533特异特异 PCR 产物产物5533经经 30 个循环，产生个循环，产生 230 个分子拷贝个分子拷贝5533一步法一步法 RT-PCR RT 反应与反应与 PCR 反应在反应在同一个试管中进行。同一个试管中进行。两步法两步法 RT-PCR RT 反应与反应与 PCR 反应在反应在不同的试管中进行。不同的试管中进行。下游引物下游引物 特异性引物特异性引物 Oligo(dT)-actin GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogena

12、se)18S rRNA用用作作内参内参的管家基因的管家基因实时实时荧光荧光定量定量PCRPCR技术技术 实现了实现了PCRPCR从从定性定性到到定量定量的飞跃的飞跃实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理指在指在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利，利用用荧光信号积累荧光信号积累实时监测整个实时监测整个PCRPCR进程，进程，最后通过标准曲线最后通过标准曲线对未知模板进行定对未知模板进行定量量分析的方法。分析的方法。特异性更强、特异性更强、有效解决有效解决PCRPCR污染、污染、自动化程度高、自动化程度高、实时监测实时监测反应过程反应过程Ct Ct 值的定义值的定义

13、在荧光定量在荧光定量PCRPCR技术中重要概念技术中重要概念 CtCt值值C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold，CtCt值：值：每个反应每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系每个模板每个模板CtCt值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小值越小。利用已知起始拷贝数标准。利用已知起始拷贝数标准品作标准曲线，品作标准曲线，横坐标横坐标起始拷贝数的对数，起始拷贝数的对数，纵

14、坐标纵坐标代代CtCt值。只要获得未知样品的值。只要获得未知样品的CtCt值，即可从标准曲线上计算值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。出该样品起始拷贝数。荧光定量PCR所使用的荧光化学荧光染料 SYBR Green I 荧光探针 TaqManTaqMan荧荧光探光探针针 Moleculae Beacons Scorpions TMScorpions TM探针探针 LightcyclerLightcycler SYBRSYBR荧光染料荧光染料 在在PCRPCR反应体系中，反应体系中，SYBR Green I荧光染荧光染料特异性地掺入料特异性地掺入DNADNA双链后双链后，发射荧光信，发射

15、荧光信号，号，光信号的增加与光信号的增加与PCRPCR产物的增加完全产物的增加完全同步。同步。对引物质量要求较高对引物质量要求较高 TaqMan荧光探针PCRPCR扩增扩增时在加入时在加入一对引物一对引物的同时加入的同时加入一个特一个特异性的荧光探针，异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，该探针为一寡核苷酸，两端两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；淬灭基团吸收；PCRPCR扩增时，扩增时，TaqTaq酶酶的的5533外切酶活性外切酶活性将探针酶切降解将探针

16、酶切降解，使报告荧光基团，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测监测系统可接系统可接收到收到荧光信号，荧光信号，即即每扩增一条每扩增一条DNADNA链，就有一链，就有一个荧光分子形成个荧光分子形成，实现了，实现了荧光信号的累积与荧光信号的累积与PCRPCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。R=Reporter(荧光报告染料荧光报告染料)Q=Quencher(淬灭物淬灭物)TaqMan 探针探针当当 TaqMan 探针完整时，探针完整时，荧光报告染料发射的荧荧光报告染料发射的荧光被淬灭物所淬灭。光被淬灭物所淬灭。在延伸反应中，在延伸反应中，荧光报荧光报告染料被告染料被 DNA 聚合酶切聚合酶切除后与淬灭物分离，其除后与淬灭物分离，其荧光荧光信号被检测。信号被检测。