氨基酸的分离---纸层析法.ppt

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1、生物化学实验生物化学实验张积森张积森（)生物化学生物化学(Biochemistry)：研究生命物质的：研究生命物质的化学组成、结构及生命活动过程中各种化化学组成、结构及生命活动过程中各种化学变化的基础生命科学学变化的基础生命科学.化学生物学（化学生物学（Chemical Biology)：利用化：利用化学手段研究生物学问题或利用生物学手段学手段研究生物学问题或利用生物学手段解决化学问题解决化学问题.IntroductionBiochemistryChemistryBiologyGeneticsMolecular BiologyBiotechnologyPharmacologyCellular

2、BiologyA Multidisciplinary Science生物化学生物化学实验实验介绍生物化学实验的原理和方法介绍生物化学实验的原理和方法动手动手!使用各种生物化学实验仪器，掌握生物化学使用各种生物化学实验仪器，掌握生物化学的各种基本实验方法和操作技能的各种基本实验方法和操作技能加深对生物化学理论知识的认识和理解。加深对生物化学理论知识的认识和理解。What should we get设计一个实验的基本思路，根据掌握的实验设计一个实验的基本思路，根据掌握的实验基本原理，严密地组织自己的实验，合理基本原理，严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间去解决所需要地安排实验步骤和时间去

3、解决所需要解决的问题解决的问题。生化实验四大生化实验四大 必杀技必杀技离心离心电泳电泳层析层析光谱光谱What should we do预习：预习：操作：安全操作：安全&什么是动手能力强？什么是动手能力强？记录：记录：Raw Data总结：总结：实验记录实验记录实验前预习，了解要学习的主要内容。实验前预习，了解要学习的主要内容。实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。试剂的浓度等。实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量实验中应及时准确地记录所

4、观察到的现象和测量的数据。即使观测的数据相同或偏差很大，也都的数据。即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改应如实记录，不得涂改实验报告实验报告（A4大小纸，计算成绩！计算成绩！)实验目的实验目的 实验原理实验原理 仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂 实验步骤实验步骤 结果讨论（含数理据处）结果讨论（含数理据处）注意事项注意事项成绩成绩考勤考勤课堂表现课堂表现实验报告实验报告笔试笔试实际操作考试实际操作考试实验一实验一 氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定 纸层析法纸层析法【实验目的实验目的】学习氨基酸纸层析法的基本原理学习氨基酸纸层析法的基本原理掌握氨基酸纸层析的操作技术掌握氨基酸纸

5、层析的操作技术 纸层析法纸层析法属于分配层析，它是以层析滤纸为属于分配层析，它是以层析滤纸为载体，以吸附于滤纸纤维羟基上的一层水（极性）载体，以吸附于滤纸纤维羟基上的一层水（极性）为固定相，流动相是有机溶剂，主要是正丁醇为固定相，流动相是有机溶剂，主要是正丁醇（非极性溶剂）。分离氨基酸是根据不同氨基酸（非极性溶剂）。分离氨基酸是根据不同氨基酸的极性，在固定相和流动相中的的极性，在固定相和流动相中的分配系数分配系数不同而不同而进行分离的（依据相似相溶原理）。进行分离的（依据相似相溶原理）。【实验原理实验原理】分配层析分配层析:利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配系利用混合物中各组分在两种不同

6、溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法。数不同而使物质分离的方法。分配系数分配系数:是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时，该溶质在两种溶剂中所具有浓度之比。到平衡时，该溶质在两种溶剂中所具有浓度之比。不同的物质因其在各种溶剂中的溶解度不同，因不同的物质因其在各种溶剂中的溶解度不同，因而也就有不同的分配系数。而也就有不同的分配系数。氨基酸被分离后在纸层析图谱上的位置是用氨基酸被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值值(比比移值移值)来表示的。来表示的。在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质

7、量和层析温度等因素有关。【实验器材与试剂实验器材与试剂】1、层析缸、层析缸 2、毛细管、毛细管 3、喉头喷雾器、喉头喷雾器 4、培养皿、培养皿 5、层析滤纸、层析滤纸6、铅笔（直尺）、铅笔（直尺）7、分液漏斗、分液漏斗 8、吹风机、吹风机9、正丁醇正丁醇10、冰醋酸、冰醋酸11、氨基酸标准样品、氨基酸标准样品12、氨基酸混合样品、氨基酸混合样品13、0.1%水合茚三水合茚三 酮正丁醇溶液酮正丁醇溶液【实验步骤实验步骤】1、配扩展剂：正丁醇：冰醋酸：水=20ml：5ml：15ml 顺序：正丁醇冰醋酸水，放入分液漏斗中，充分混匀。静置约10min后分层，放出下层水层，其余的倒入培养皿中。2.准备滤

8、纸准备滤纸 取一张层析滤纸，距纸底边2cm处用铅笔划一横线，沿线每隔2.5cm作一记号为点样处，点样处也不要太靠近两侧边（约距1.5cm），会产生边缘效应。3.点样点样（顺纸纹方向）用毛细管依次吸取标准品氨基酸和混合样，吸管与滤纸垂直，轻轻接触纸面，样品扩散直径小于3mm。一滴滴完后用冷风冷风(低温）低温）吹干，再点第二次，共点三次。4.扩展扩展 将点完样的滤纸两侧面对齐，将点完样的滤纸两侧面对齐，用针线缝合，纸的两边不能接触。用针线缝合，纸的两边不能接触。将点样后的滤纸直立于培养皿的将点样后的滤纸直立于培养皿的扩展剂中，（点样的一端在下，扩展剂中，（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线扩

9、展剂的液面需低于点样线1 cm）当溶剂展层至滤纸上沿）当溶剂展层至滤纸上沿2cm处处展层结束，取出滤纸。用铅笔画展层结束，取出滤纸。用铅笔画出展层前沿位置，在出展层前沿位置，在通风橱中通风橱中用用热风热风吹干。吹干。5.显色显色 用喉头喷雾器均匀用喉头喷雾器均匀喷上喷上0.1茚三酮正丁茚三酮正丁醇溶液，然后用醇溶液，然后用热风热风吹干即可显出各层析吹干即可显出各层析斑点。斑点。6.测量、计算：测量、计算：分别测量分别测量X、Y值，值，计算各氨基酸的计算各氨基酸的Rf值。值。Rf=XY注意事项注意事项1、手尽量小心接触滤纸，顺纸纹方向层析。、手尽量小心接触滤纸，顺纸纹方向层析。2、吸取样品的毛细

10、管不可混用。、吸取样品的毛细管不可混用。3、点样圈不能距离纸边太近，各点之间的距、点样圈不能距离纸边太近，各点之间的距 离不能太近。离不能太近。4、吹干时一定要保证完全吹干。、吹干时一定要保证完全吹干。5、缝合时，滤纸的两个纸边不能相互接触并、缝合时，滤纸的两个纸边不能相互接触并且底边应对齐，点样线一面滤纸朝外。且底边应对齐，点样线一面滤纸朝外。6、点样时，样品扩散圈不能过大，直径小于、点样时，样品扩散圈不能过大，直径小于3mm。7、使用移液管时应右手拿管，左手拿吸耳球、使用移液管时应右手拿管，左手拿吸耳球并用食指堵管口。并用食指堵管口。8、使用移液管时，应先看清管的最大刻度，、使用移液管时，

11、应先看清管的最大刻度，每一格代表多少后再量取。每一格代表多少后再量取。9、15ml水是用蒸馏水，在水槽边的大玻璃瓶中。水是用蒸馏水，在水槽边的大玻璃瓶中。10、实验结束请清洗实验玻仪，但不要清洗展层缸实验结束请清洗实验玻仪，但不要清洗展层缸及其中的培养皿。及其中的培养皿。11、有机废液倒入右侧实验台上的、有机废液倒入右侧实验台上的“废液收集有机废液收集有机溶剂溶剂”大试剂瓶中。大试剂瓶中。12、实验结束实验结束,回收竹夹子、回收竹夹子、A4复印纸、电吹风。复印纸、电吹风。13、实验报告要写同组同学号数、名字，层析滤纸、实验报告要写同组同学号数、名字，层析滤纸贴在其中一位同学的实验报告上。贴在其

12、中一位同学的实验报告上。14、坐椅推入实验台下，空出过道。、坐椅推入实验台下，空出过道。【结果分析与讨论结果分析与讨论】【思考题思考题】通过本次实验，讨论下列问题：（1）简述纸层析的原理。（2）判断氨基酸极性大小顺序，讨论AA极性与Rf的关系？（3）什么是Rf值？影响的主要因素是什么？操作流程：操作流程：点样层析显色滤纸一边滤纸一边2厘米处划线，在线上等距离划厘米处划线，在线上等距离划5个点。个点。毛细管吸样品点样，直径小于毛细管吸样品点样，直径小于0.3cm，电吹风吹干，重复一次。干燥后将滤纸卷成圆形，电吹风吹干，重复一次。干燥后将滤纸卷成圆形，缝合滤纸，注意两边缘不能接触。缝合滤纸，注意两

13、边缘不能接触。将滤纸垂直放置在培养皿中，盖紧缸盖。将滤纸垂直放置在培养皿中，盖紧缸盖。层析结束后层析结束后取出滤纸，电吹风吹干，划前沿线。取出滤纸，电吹风吹干，划前沿线。喷雾器均匀喷上茚三酮茚三酮溶液，电吹风热风吹干至看到AA彩色斑点。用铅笔将图谱上的斑点圈出，测Rf相关值。展层剂的配制正丁醇正丁醇:冰醋酸冰醋酸:水水=20mL:5mL:15mL放置分放置分液漏斗中，塞上塞子，充分振荡，静置分层。液漏斗中，塞上塞子，充分振荡，静置分层。（先混和正丁醇和冰醋酸）（先混和正丁醇和冰醋酸）弃下层水层。放弃下层水层。放10mL左右于培养皿中，并置于密闭的层析缸中。左右于培养皿中，并置于密闭的层析缸中。

14、下次实验下次实验总氮量的测定凯氏定氮法总氮量的测定凯氏定氮法（405实验室）实验室）氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。氨基连在-碳上的为-氨基酸。组成蛋白质的氨基酸均为-氨基酸。必需氨基酸（必需氨基酸（essential amino acid）：）：指人体（或其它脊椎动物）不能合指人体（或其它脊椎动物）不能合成或合成速度远不适应机体的需要，必需由食物蛋白供给，这些氨基酸称为必需成或合成速度远不适应机体的需要，必需由食物蛋白供给，这些氨基酸称为

15、必需氨基酸。成人必需氨基酸的需要量约为蛋白质需要量的氨基酸。成人必需氨基酸的需要量约为蛋白质需要量的20%37%。共有。共有8种其种其作用分别是：作用分别是：赖氨酸：促进大脑发育，是肝及胆的组成成分，能促进脂肪代谢，赖氨酸：促进大脑发育，是肝及胆的组成成分，能促进脂肪代谢，调节松果腺、乳腺、黄体及卵巢，防止细胞退化；调节松果腺、乳腺、黄体及卵巢，防止细胞退化；色氨酸：促进胃液及胰液的产生；色氨酸：促进胃液及胰液的产生；苯丙氨酸：参与消除肾及膀胱功能的损耗；苯丙氨酸：参与消除肾及膀胱功能的损耗；蛋氨酸（甲硫氨酸）：参与组成血红蛋白、组织与血清，有促进蛋氨酸（甲硫氨酸）：参与组成血红蛋白、组织与血清，有促进脾脏、胰脏及淋巴的功能；脾脏、胰脏及淋巴的功能；苏氨酸：有转变某些氨基酸达到平衡的功能；苏氨酸：有转变某些氨基酸达到平衡的功能；异亮氨酸：参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节以及代谢；脑下腺属异亮氨酸：参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节以及代谢；脑下腺属总司令部作用于甲状腺、性腺；总司令部作用于甲状腺、性腺；亮氨酸：作用平衡异亮氨酸；亮氨酸：作用平衡异亮氨酸；缬氨酸：作用于黄体、乳腺及卵巢缬氨酸：作用于黄体、乳腺及卵巢