土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1).ppt

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1、课题课题2土壤中分解尿素的细菌土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的分离与计数尿素尿素CO(NHCO(NH2 2)2 2重要的农业氮肥。重要的农业氮肥。只有被土壤中细菌分解为只有被土壤中细菌分解为NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用脲酶脲酶课题背景课题背景CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3 1 1、实例：、实例：PCRPCR技术技术技术技术启示：启示：原因：原因：PCRPCR技术：要求使用耐技术：要求使用耐高温（高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚聚合酶。合酶。（一一）筛筛选选菌菌株株筛选：筛选：TaqTaq细菌细菌因为热泉温度因为热泉温度707080800C C，

2、淘汰了绝大多，淘汰了绝大多数微生物。数微生物。寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。求，到相应的环境中去寻找。2 2、实验室中微生物的筛选原理、实验室中微生物的筛选原理人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pHpH等等)，同时抑制或阻止其他微生物，同时抑制或阻止其他微生物生长。生长。KHKH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4H H2 2O 0.2gO 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g

3、 尿素尿素 1.0g1.0g 琼脂琼脂 15.0g15.0g 将上述物质溶解后，将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到1000mL1000mL。该培养基的配方中，为微该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？分别是什么物质？此配方能否筛选出产生脲酶此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮细菌能利用尿素作为氮源而生存。源而生存。能分解尿素的细菌的筛选能分解尿素的细菌的筛选根据培养基配方，回答下列问题：根据培养基配方

4、，回答下列问题：结果：结果：培养一培养一定时定时间后，该菌数间后，该菌数量上升，再通量上升，再通过过稀释涂布平板等稀释涂布平板等方法对它进行方法对它进行纯化培纯化培养分离。养分离。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做养基，称做选择培养基。选择培养基。方法方法运用运用稀释涂布平板法稀释涂布平板法来来统计统计样品中的样品中的活菌活菌数。数。（二）（二）统计菌落数目统计菌落数目原理原理1 1个菌落个菌落1 1个活菌个活菌为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，

5、一般选择菌落数在3030030300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值，需培养计算出为使结果接近真实值，需培养计算出三个或三个三个或三个以上以上的平板菌落的平板菌落平均数平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低低。注意事项注意事项 阅读教材阅读教材2222页页“（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目”一段，并讨论教一段，并讨论教材中提出的问题。材中提出的问题。甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板）乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值计算公式：计算公式：某同学在稀释倍

6、数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4 B每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（CV）M二、实 验 设 计 菌落菌落计数计数制培养制培养基基样品稀释样品稀释涂布平板涂布平板土壤取样土壤取样准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显数目应明显多于多于选择培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋牛肉膏蛋白胨培养

7、基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了到了选择选择作用。作用。（1 1）制培养基）制培养基（2 2）土壤取样）土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消毒处理）表层土消毒处理）表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先灭左右，再取样，将样品装入事先灭菌过的信封中。菌过的信封中。稀释倍数为稀释倍数为 10101 1 10106 6。每个稀释度均用。每个稀释度均用3 3个选择培养基。个选择培养基。（3 3）样品稀释涂布）样品稀释涂布（4 4）微生物的培养与观察）微生物的培养与观察在在菌落

8、计数时，每隔菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数统计一次菌落数目。目。选选取菌落数目稳定时的记录作为结果，取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培培养不同微生物往往需要不同培养温养不同微生物往往需要不同培养温度。度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。三、结果分析与评价 1.1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落否筛选出菌落

9、对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。已筛选出一些菌落。2.2.样品的稀释操作是否成功样品的稀释操作是否成功 如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。的计数。3.3.重复组的结果是否一致重复组的结果是否一致 如果各位

10、同学选取的是同一种土样，统计的结如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操作过程中去分析、寻找可能的原因。作过程中去分析、寻找可能的原因。四、课 题 延 伸 能分解尿素的细菌的鉴定能分解尿素的细菌的鉴定鉴定的原理：鉴定的原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的pHpH升高。升高。鉴定方法：鉴定方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，利在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化。用此培养基进行细菌培养，观

11、察培养基的颜色变化。COCO（NHNH2 2）2 2+H+H2 2O OCOCO2 2+2NH+2NH3 3脲酶pHpH升高升高指示指示剂剂（酚（酚红红）将）将变红变红本课题知识小结本课题知识小结:1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是别是()()A.COA.CO2 2和和N N2 2 B.B

12、.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练C CD D3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚 合酶。合酶。B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值。作为该样品菌落数的估计值。C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素设置对照实验的主要目的是排除实验组中非

13、测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。4.4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C1.1.在以在以尿素尿素为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将升高，指示剂将变红变红，说明该细菌能够，说明该细菌能够分解尿素。分解尿素。2.2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到滤膜放到 伊红伊红-美蓝美蓝 培养基上培养，大培养基上培养，大肠杆菌肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记算得出水，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。样中大肠杆菌的数量。五五.课外延伸课外延伸大肠杆菌呈黑色大肠杆菌呈黑色,中心有或无金属光泽中心有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征