基础医学细胞凋亡及其调控分子机制.pptx

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1、第1页/共117页1.凋亡的概念，与坏死的区别2.凋亡信号通路3.细胞凋亡相关蛋白、细胞凋亡与疾病4.细胞凋亡检测第2页/共117页细胞凋亡细胞凋亡名称的由来名称的由来英国英国AberdeenAberdeen大学病理系大学病理系 KerrKerr教授教授19721972年我和年我和WyllieWyllie在研在研究中观察到一种不同于究中观察到一种不同于坏死的细胞死亡方式，坏死的细胞死亡方式，联想到秋日落叶，我们联想到秋日落叶，我们 就把它称作就把它称作Apoptosis第3页/共117页第4页/共117页 Sydney Brenner 1/3 of the prize United Kingd

2、om The Molecular Sciences Institute Berkeley,CA,USA b.1927(in Union of South Africa)H.Robert Horvit 1/3 of the prize USA Massachusetts Institute of Technology(MIT)Cambridge,MA,USA b.1947John E.SulstonUnited Kingdom The Wellcome Trust Sanger Institute Cambridge,United Kingdom b.1942THE2002NOBELPRIZEW

3、INNER第5页/共117页王晓东：王晓东：从事的是细胞凋亡规律从事的是细胞凋亡规律的研究。的研究。20002000年，他和助手年，他和助手们进行了一项实验，研究一种们进行了一项实验，研究一种神秘的线粒体蛋白质神秘的线粒体蛋白质SmacSmac，这种蛋白质可以打破肿瘤的这种蛋白质可以打破肿瘤的“坚硬堡垒坚硬堡垒”，诱使肿瘤细胞，诱使肿瘤细胞“自杀自杀”，对研究治疗癌症方法，对研究治疗癌症方法有重要帮助。从有重要帮助。从19961996年他建年他建立起自己的研究室后，他的论立起自己的研究室后，他的论文成果在文成果在8 8年间被其他科学家年间被其他科学家引用超过了引用超过了1500015000次。

4、次。第6页/共117页第一节细胞凋亡的特征及意义一、细胞凋亡的基本特征第7页/共117页程程序序性性细细胞胞死死亡亡programmedcelldeath,PCD在在发发育育过过程程中中定定时时出出现现的的生生理理性性刺刺激激诱诱导导的的细细胞胞死死亡亡。用用于于选选择择性性地地清清除除多多细细胞胞动动物物体体内内一一些些无无用用的的或或危险的细胞。危险的细胞。依依据据形形态态学学不不同同，程程序序性性细细胞胞死死亡亡可可划划分分为为凋凋亡亡（apoptosis）、自自噬噬（autophagy）、肿胀性死亡）、肿胀性死亡3种形式。种形式。细细胞胞凋凋亡亡：apoptosis在在生生理理和和病病

5、理理条条件件下下，由由基基因因控控制制的的自自主主有有序序的的死死亡亡过程。过程。生生理理条条件件下下，凋凋亡亡用用以以清清除除单单个个细细胞胞，继继而而由由巨巨噬噬细细胞胞内内吞吞，最最后后再再由由溶溶酶酶体执行降解功能。体执行降解功能。自自噬噬autophagy:是是一一种种在在进进化化上上保保守守的的真真核核细细胞胞内内转转运运泡泡的的运运输输机机制制，它它可可将将细细胞胞本本身身的的亚亚细细胞胞成成分分如如蛋蛋白白、胞胞质质或或细细胞胞器器，通通过过溶溶酶酶体体中中的的水水解解酶酶进行消化降解和循环。进行消化降解和循环。凋亡和自噬都是细胞内重要的生理过程。凋亡和自噬都是细胞内重要的生理

6、过程。坏死坏死Necrosis：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。胞的意外死亡。第8页/共117页诱发因素特定的生理病理因素，药物缺氧、药物、毒素组织分布单个细胞分布成片细胞组织反应形成凋亡小体，被周围组织细胞内容物溶解 细胞吞噬，无炎症反应 释放，有炎症反应 坏死凋亡第9页/共117页形态学：细胞体积皱缩变圆，细胞浆失水浓缩肿胀，外形不 规则化细胞膜保持完整，保持完整，形成泡状，凋亡形成泡状，凋亡 破裂破裂 后期内陷包裹核物质和细胞器后期内陷包裹核物质和细胞器 形成凋亡小体形成凋亡小体细胞核核膜完整，核皱缩，

7、染色质固缩核肿胀破裂，聚集在核膜下，最后核裂成碎片 染色质不规 则 外移细胞器大多数保持完整，线粒体肿胀，多受损，溶 通透性增加，释放细胞色素 酶体破裂，线 粒体肿胀破裂凋亡坏死第10页/共117页DNA 阶梯状片段化 随机断裂 磷脂 凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻 外翻 ATP 合成并提供能量 耗竭 凋亡坏死生物化学：出现出现180-200bp180-200bp大小及其倍数的核苷酸片段，大小及其倍数的核苷酸片段，DNA LADDERDNA LADDER第11页/共117页细胞坏死与凋亡的形态区别第12页/共117页第13页/共117页细胞凋亡的诱发因素细胞凋亡的诱发因素 生理性因素生理性因素 损伤

8、刺激损伤刺激 肿瘤坏死因子家族 病毒感染 FasL、TNF P53、PTEN 转化生长因子 细胞毒素 细胞癌基因 自由基 神经递质神经递质治疗因素治疗因素 谷氨酸、多巴胺 化疗药物 去除细胞生长因子 紫外线 基质失去粘附特性 中草药第14页/共117页细胞凋亡的生理意义细胞凋亡的生理意义1、确保正常发育、生长，确保正常发育、生长，根据代谢需要调节细根据代谢需要调节细胞数量、保持成体器官正常体积。胞数量、保持成体器官正常体积。如：指（趾）间隙的形成如：指（趾）间隙的形成2、维持内环境稳定维持内环境稳定如：清除受损、突变或衰老的细胞如：清除受损、突变或衰老的细胞3、防御功能防御功能如：使受到病毒感

9、染的细胞凋亡如：使受到病毒感染的细胞凋亡第15页/共117页第二节 细胞凋亡的发生机制 一、凋亡相关基因（一）ced基因线虫（c.elegans），1090个体细胞，其中131个细胞在发育过程中产生凋亡，发现14个基因与凋亡有关；且虫体透明，易于观察。第16页/共117页细胞内与凋亡有关的基因分2类：1存活基因：存活基因：ced-9：bcl-2蛋白家族蛋白家族2致死基因：致死基因：ced-4：凋亡蛋白酶活化因子凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1,apoptosisproteaseactivatingfactor-1,3.致死基因：致死基因：ced-3：Caspase家族(cycteinylaspa

10、rtate-specificprotease).天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶线虫人类第17页/共117页Caspase：1996 年 Alnemri 等统一命名的一类与与ICE/Ced-3 同源性同源性半胱氨酸蛋白酶。（二）caspase caspase 与细胞凋亡第18页/共117页1.1.特点：(1)是一种Cys 蛋白酶(2)底物Asp-X(3)以酶原形式存在(4)活化的Caspase 特异性水解一套底物，导致不可逆的细胞凋亡(5)细胞内有Caspase抑制剂。IAP,inhibitors of apoptosis proteins第19页/共117页2.结构特征结构特征以无活性的形式存在

11、。以无活性的形式存在。在在Pro-Caspases的的NN端均含有一段的前区域端均含有一段的前区域（Prodomain）。活性形式均是由活性形式均是由2 2个大亚基和个大亚基和2 2个小亚基组成的个小亚基组成的杂四聚体。杂四聚体。一分子一分子Pro-Caspase只能分裂产生只能分裂产生1 1个大亚基和个大亚基和1 1个小亚基个小亚基 。大大亚亚基基的的C C端端含含有有活活性性中中心心，其其中中半半胱胱氨氨酸酸（C C）是必需氨基酸，故属于半胱氨酸蛋白酶类。）是必需氨基酸，故属于半胱氨酸蛋白酶类。第20页/共117页3.3.分类：1414种 （1）细胞因子前体：caspase caspase

12、 1，4，5，11，12，13，14不是凋亡的直接效应分子。（2）凋亡起始分子：caspase caspase 2，8，9，10（3）凋亡效应分子：caspasecaspase 3，6，7参与介导细胞凋亡。第21页/共117页ICE家族成员A：3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B：caspase-3的结构模型；C：caspase-3的活化过程执行者启动者第22页/共117页4.4.caspase活化：Caspase酶原有很低的活性若caspase过表达，酶原在高浓度下可自身活化Caspase8，9含有死亡效应域（deatheffectdomain,DED），可相

13、互作用，使酶原自身活化。Caspase8：激活所有酶原,如:Caspase3,6,7,9Caspase9：活化需线粒体释放CytC,活化后激 活Caspase2,3,6,8,10。Caspase3,6,7:效应Caspase。第23页/共117页第24页/共117页5.Caspase 作用：（1 1）灭活细胞凋亡抑制蛋白:鼠鼠:CaspaseCaspase活化的活化的DNADNA酶酶:Caspase activated:Caspase activated deoxyribonuclease,CADdeoxyribonuclease,CAD，细胞凋亡抑制物：细胞凋亡抑制物：inhibitorof

14、CAD,ICADICADICAD与与CADCAD结合，结合，CADCAD无活性，无活性，CaspaseCaspase剪切剪切ICADICAD，ICADICAD失活，失活，CADCAD活化，活化，CADCAD游离，进入细胞核内降解游离，进入细胞核内降解DNADNA。人：人：Hela cellHela cell，DFFDFF（DNA fragment factor)DNA fragment factor)，与ICADICAD同同源源第25页/共117页Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶：依赖的核酸内切酶：多聚多聚ADP-核糖聚合酶（核糖聚合酶（polyADP-ribosepolymerase,PA

15、RP）抑制）抑制Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶依赖的核酸内切酶,与基因完整性的监护有关。与基因完整性的监护有关。PARP降解，降解，Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶依赖的核酸内切酶活性增加活性增加，裂解核小体间的裂解核小体间的DNA，导致细胞凋亡。，导致细胞凋亡。Caspase第26页/共117页（2 2）降解细胞结构蛋白：降解核纤层蛋白，肌动蛋白，核分裂相关蛋白(3)切割细胞效应蛋白。(4)降解其他的caspases第27页/共117页6.Caspase活化抑制剂 IAP,inhibitorsofapoptosisproteins 细胞内存在的Caspase抑制蛋白，IAPinhibi

16、torsofapoptosisproteins家族，阻止细胞凋亡过程。第28页/共117页第29页/共117页二、细胞凋亡的诱导发生 细胞凋亡的信号传递（1）Fas介导细胞凋亡（2）细胞色素C介导的细胞凋亡 （3 3）粒酶GrB诱导细胞凋亡第30页/共117页12第31页/共117页第32页/共117页DR：死亡受体：死亡受体deathreceptors,DR含DD：死亡结构域，deathdomain,DD（DD存在于DR之胞内区，和FADD蛋白中）FADD蛋蛋白白：Fas相关的死亡结构域，Fas-associateddeathdomain（FADD蛋白含有DD，DED；可与pro-caspa

17、se8结合）DED：死亡效应结构域，deatheffecterdomain,DED（存在于FADD蛋白、一些起始caspase酶原如pro-caspase8中）（1）死亡受体介导的细胞凋亡（外源性的）第33页/共117页Fas-细胞表面受体，跨膜蛋白；共4个蛋白第34页/共117页1.FasLigand（FasL）是Fas 的天然配体，两者介导细胞凋亡，Fas L主要在淋巴细胞膜上表达。2.FasFas/Apo-1存在于细胞表面的特定区域，一旦被Fas L或Fas抗体激活，可将信号传递到细胞内。Fas 属肿瘤坏死因子受体(TNFR)及神经生长因子受体（NGFR）超家族，是细胞凋亡的受体信号，又

18、叫死亡分子。Fas/Apo-1(CD95)Fas/Apo-1(CD95)第35页/共117页Fas从人KT3细胞株分离的cDNA克隆。Apo-1从人SKW6.4细胞株分离的cDNA克隆。后来证明两者完全一致，命名为Fas/Apo-1，或称CD95。Fas蛋白位于10q33，编码335AA，成熟319AA，是跨膜蛋白。由胞外区，跨膜区、胞内区组成。胞内区有80AA,称死亡结构域（deathdomain,DD）第36页/共117页3.FADD蛋白:Fas相关死亡结构域蛋白：Fas-associated death domain protein 包括：DD，死亡结构域 death domain DE

19、D，死亡效应结构域 death effect domain第37页/共117页Deathinducingsignalcomples,DISC第38页/共117页FasL与Fas结合(同三聚体)Fas的DD成簇，与FADD蛋白结合，FADD蛋白活化Caspase8活化Caspase3，6，7活化细胞凋亡（1）Fas介导细胞凋亡死亡诱导信号复合物Deathinducingsignalcomplex,DISC第39页/共117页诱导因素跨膜电位（m）PTP开放（通透性转换孔）凋亡启动因子（细胞色素C，smac，AIF）释出AIF：凋亡诱导因子（2）线粒体相关的细胞凋亡途径（内源性的）现在，提得最多的

20、、比较现在，提得最多的、比较公认的线粒体在凋亡中的公认的线粒体在凋亡中的作用有两点：作用有两点：（1）细胞色素）细胞色素C的释放；的释放；（2）Smac/Diablo的释放。的释放。第40页/共117页第41页/共117页 （2 2）细胞色素C介导的细胞凋亡CytC释放入胞质与胞浆接头蛋白Apaf-1结合Apaf-1寡聚化，募集Caspase9原Caspase9活化Caspase2,3,6,8,10活化细胞凋亡凋亡蛋白酶激活因子1，Apoptotic protease activating factor-1Caspase Caspase recuitment recuitment domain

21、domain第42页/共117页5Fas介导细胞凋亡Caspase8活化第43页/共117页凋亡诱导因子凋亡蛋白酶激活因子EndoG:endonucleaseG核酸内切酶GAIF：ApoptosisinducingfactorsApaf-1:Apoptoticproteaseactivatingfactor-1第44页/共117页 线粒体仍有足够的线粒体仍有足够的CytC，及其他细胞色素，呼吸链完，及其他细胞色素，呼吸链完整，产生整，产生ATP，保证，保证Caspase活化活化，细胞凋亡。，细胞凋亡。CytC释放过多，呼吸链破坏，氧消耗，但是不产生释放过多，呼吸链破坏，氧消耗，但是不产生ATP

22、，导致细胞坏死，导致细胞坏死。细胞含有细胞含有caspase抑制剂，不能导致抑制剂，不能导致caspase依赖的细胞凋依赖的细胞凋亡；亡；当线粒体巨通道破坏，Cyt C释放：第45页/共117页AKtJNKp53Bcl-2第46页/共117页（3）粒酶的基本结构和功能定义：粒酶，粒酶，Granzyme，Gr，是，是CTL和和NK细细胞胞杀伤性颗粒中杀伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称，以酶丝氨酸蛋白酶家族的总称，以酶原形式存在。原形式存在。分类：GrA,GrB,GrH,GrM,类胰蛋白酶2功能：酶切靶细胞的多种底物蛋白，启动细胞凋亡。GrB活性最高，与其他粒酶，穿孔素（PEN,Perforin）

23、一起储存在CTL的杀伤颗粒中。第47页/共117页粒酶进入靶细胞：CTL识别靶细胞，杀伤性颗粒移向靶细胞一极（极化）GrB,PEN等蛋白释放入细胞间隙穿孔素(PEN)协助GrB进入靶细胞，定位在胞浆和胞核第48页/共117页第49页/共117页CTL肿瘤细胞肿瘤细胞CTL正在诱导肿瘤细胞凋亡正在诱导肿瘤细胞凋亡第50页/共117页GrB诱导细胞凋亡（1）Caspase依赖途径：GrB切割Caspase10Caspase3,7,PARP(多聚ADP核糖聚合酶)，Bid，DNA片段化因子(DFF)细胞凋亡GrB确保靶细胞即使缺失1种或几种Caspase成员时，仍能走向凋亡。第51页/共117页切割

24、DFF，使CAD游离，降解DNA结构蛋白Filamin，使细胞骨架破坏PARP，使Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶活性增加，裂解核小体间的DNA 细胞凋亡GrBDFF：DNA片段化因子CAD：caspase活化DNA酶PARP：多聚ADP-核糖聚合酶人：Helacell，DFF（DNAfragmentfactor)，与ICAD同源第52页/共117页（2 2）GrB介导线粒体凋亡途径 GrB切割胞浆Bid，产生活化Bid（tBid）tBid移至线粒体，募集Bax，诱导线粒体释放CytC，Smac等因子，细胞凋亡 诱导线粒体开启膜通透性孔道PTP，破坏线粒体内膜电位，损伤线粒体功能，导致细胞死

25、亡。第53页/共117页第54页/共117页第55页/共117页第三节细胞凋亡的调控细胞自身蛋白的调控作用（一）P53（二）Bcl-2家族蛋白（三）c-myc（四）IAP家族蛋白第56页/共117页细胞凋亡的细胞凋亡的相关相关调控调控基因基因抑制凋亡基因：Bcl-2、IAPs促进凋亡基因:Fas、Bax、P53、双向调控基因:c-myc第57页/共117页(一)P53野生型的P53蛋白是一种包含393AA的转录因子，活性形式为四聚体，自N端起依次包括转录活化区，DNA结合区，四聚体化区，C端调节区。1.P53表达细胞中的DNA损伤，纺锤丝断裂，癌基因异常激活，缺氧，ATP储备下降等信号都能导致

26、p53表达增加。已发现有数十种p53的相互作用蛋白，P53在胞浆中的含量受到严密的监控。第58页/共117页2.2.P53对细胞周期和凋亡的调节（1）抑制细胞周期p53主要作用于细胞周期的G1/S期，G2/M期等检查点，并引起细胞周期停滞于G1或G2期。p53通过促进p21的表达，抑制如cyclinD-CDK4,cyclinE-CDK2等的活性，引起细胞周期阻滞于G1期。细胞周期负调节因子14-3-3sigma是p53下游靶基因之一，主要通过调节细胞周期的G2/M检查点引起G2期阻滞，且与p21有相互增强作用。第59页/共117页（2）促进细胞凋亡细胞周期在G1，G2/M期的停滞为细胞DNA修

27、复提供了时间，一一旦旦修修复复失失败败，p53则在其他因素作用下，有效诱导细胞凋亡。P53促进一系列细胞凋亡的相关分子的表达如Fas，DR5，Bax，Apaf-1，Noxa，PUMA等，增加细胞对凋亡信号的敏感性。P53:molecular policeman?第60页/共117页第61页/共117页（二）Bcl-2Bcl-2家族蛋白的调控作用（1）Bcl-2家族的结构Bcl-2Bcelllymphoma/leukemia-2两个结构域：羧基端的跨膜结构域Bcl-2同源结构域（Bcl-2homology,BH）Bcl-2229aa构成，分布在线粒体内膜，细胞内膜表面，内质网，核膜等处Bcl-2

28、和C.elegans中的ced-9有很高的同源性，具有促进细胞存活的功能Bcl-2的功能是延长细胞的寿命，而不是刺激细胞的增殖第62页/共117页Bcl-2家家族分子族分子结构结构第63页/共117页(2)(2)BcL-2的同源基因和蛋白质的同源基因和蛋白质抗凋亡作用，抗凋亡作用，促凋亡作用，有促凋亡作用，有Bax，Bak,BH3onlyprotein:BcL-2基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力，基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力，BcL-2家族的蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡。家族的蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡。第64页/共117页

29、Bcl-2,Bax,Bcl-xs对凋亡的作用：因此，Bcl-2表达增加，并不一定抑制凋亡（1）Bax/Bax形成二聚体，诱导凋亡（2）Bcl-2/Bax二聚体更稳定，Bcl-2增加，Bcl-2/Bax增加，Bax/Bax减少，抗凋亡。（3）Bcl-xs存在，与Bcl-2形成二聚体，Bcl-2/Bax减 少，B Bax/Bax增加，诱导凋亡第65页/共117页(3)Bcl-2抗凋亡机制n直接的抗氧化n抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质n抑制促凋亡的Bax，Bak的作用n抑制Caspases激活n维持细胞钙稳态第66页/共117页（三）c-myc8q24，编码产物p62，在核内，具有转录因子活性，调节基

30、因转录。功能：促进细胞增殖。c-myc低水平时，细胞生长停滞。c-myc表达，血清生长因子存在时，促进细胞增殖。c-myc表达，血清生长因子不存在时，促进细胞凋亡。几乎所有肿瘤都有c-myc基因的异常表达（高表达）。第67页/共117页（四）IAP家族蛋白IAP(inhibitorofapoptosisproteins)家族蛋白是细胞凋亡抑制蛋白家族，已发现8个IAP家族成员，NIAP,cIAP-1,cIAP-2，XIAP,survivin,BRUCE,livin,ILP-2第68页/共117页（1）IAP直接抑制Caspase途径的caspase3，7，9的活性。如在Fas/caspase8

31、途径中，IAP抑制caspase3活性而发挥抑制。在CytC/Apaf-1途径中，XIAP直接与caspase9酶原结合，抑制caspase9活化；又结合caspase3，抑制caspase3作用。（2）作用于TNFR介导的信号传导通路，抑制细胞凋亡。作用：第69页/共117页第70页/共117页第五节细胞凋亡与疾病 细胞增殖过快及凋亡过少均在肿细胞增殖过快及凋亡过少均在肿瘤的发生中起了重要作用瘤的发生中起了重要作用P53突变，突变，Bcl-2的高表达在许多肿的高表达在许多肿瘤中都存在瘤中都存在第71页/共117页CarcinogensMutatep53BladderBloodBrainBre

32、astColonEsophagusLiverLungSpleenThyroidCancerTypesChemicalsVirusesRadiationMutatep53Gene第72页/共117页正常机体细胞生长与死亡的平衡正常机体细胞生长与死亡的平衡生长生长坏死、凋亡坏死、凋亡正常机体正常机体细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病第73页/共117页凋凋 亡亡 相相 对对 不不 足足肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等第74页/共117页 肿瘤肿瘤肿瘤的重要发病机制肿瘤的重要发病机制:细胞增殖过度细胞增殖过度细胞凋亡受抑、死亡不足细胞凋亡受抑、死亡不足病病变变组组织织内内细

33、细胞胞存存活活死死亡亡,肿肿瘤瘤细细胞胞数数目目的的净净增增长加大长加大可可能能机机制制：Bcl-2高高表表达达、IAPs高高表表达达，P53基基因因突突变变从从发发病病学学上上，细细胞胞凋凋亡亡实实际际是是机机体体天天然然的的抗抗癌癌机机制之一制之一第75页/共117页细细胞胞凋凋亡亡过过度度神经退行性疾病、造血衰神经退行性疾病、造血衰竭性疾病、竭性疾病、心肌缺血心肌缺血/再灌注损伤再灌注损伤第76页/共117页 心血管疾病心血管疾病 心肌缺血、缺血心肌缺血、缺血-再灌伤所致再灌伤所致心肌细胞死亡：心肌细胞死亡：坏死和凋亡坏死和凋亡 可能机制：氧化应激、钙超载、可能机制：氧化应激、钙超载、p

34、53p53基因激活基因激活 心心肌肌细细胞胞凋凋亡亡造造成成心心肌肌细细胞胞数数量量减减少少也也可可能能是是心心力衰竭发生、发展的主要原因之一力衰竭发生、发展的主要原因之一细细 胞胞 凋凋 亡亡 过过 度度第77页/共117页第四节 细胞凋亡的检测方法一、形态学检测（一）HE染色（二）透射电镜观察（三）荧光显微镜观察 第78页/共117页透射电镜观察 凋亡早期，染染色色体体核核边边集集，在核膜周围边聚形成新月体形，随之染色体发生固缩，呈电子密度增强，核形不规则。核膜表面凹凸不平，核发生碎裂。细胞体积变小，细胞浆浓缩，其内的细胞器保存较好，或轻度增生。线粒体数目轻度增加和轻度肿胀，细胞浆可见空泡

35、增多，细胞膜保持完整细胞膜保持完整。细胞膜表面微茸毛和伪足减少或消失。凋亡晚期，可见膜包裹内有较完整细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。第79页/共117页apoptosisapoptosis概 述第80页/共117页荧光显微镜观察 fluorescentmicroscope Hoechst33258,Hoechst33342,均为DNA特异性染料，与AT键结合，在pH2.0时优先与RNA结合，染色DNA时应调pH7.0。染料不溶于磷酸缓冲液，所以配制时先必须用蒸馏水溶解，4避光保存。染料对死细胞或70冷乙醇处理的细胞可立即染色，对活细胞的染色是渐进的，在10min内可达到饱和。第81页/共117页

36、第82页/共117页第83页/共117页二、生化检测 （一）琼脂糖凝胶电泳（二）原位末端标记技术第84页/共117页（一）琼脂糖凝胶电泳原理：染色体从核小体间断裂，为原理：染色体从核小体间断裂，为180200bp或其倍数组成的寡核苷酸片段。或其倍数组成的寡核苷酸片段。通过提取通过提取DNA，电泳，电泳，UV下，可见下，可见DNALadder。观察：凋亡细胞Ladder坏死细胞Smear第85页/共117页第86页/共117页操作：收集细胞，PBS洗涤细胞裂解液酚抽提氯仿异戊醇抽提无水乙醇沉淀TE溶解 电泳 观察第87页/共117页观察：凋亡细胞 Ladder 坏死细胞 Smear坏死 凋亡1

37、2 3 4 5 M 7 8 9Marker 10000 Marker 10000 bpbp，7500 7500 bpbp，5000 5000 bpbp，2500 2500 bpbp，1000 1000 bpbp，250bp250bpDNADNA电泳电泳第88页/共117页第89页/共117页（二）原位末端标记技术原位末端标记是：将渗入到凋亡细胞的外源性核苷酸（生物素标或荧光标）在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下，与断裂的ssDNA或dsDNA聚合，再通过显色系统显示。通常的方法是：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminaldeoxynucleotidyltransferase

38、mediateddUTPnickendlabeling,称TUNEL）第90页/共117页常用的标记和显色系统：生物素标记的dUTP地高辛标记的dUTP荧光素标记的dUTP 显色系统：辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体和DAB,辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和DAB,荧光素标记的dUTP(FITC-dUTP)，流式细胞仪或荧光显微镜观察。第91页/共117页第92页/共117页该技术不能区分凋亡、坏死、自溶性死亡的细胞，必须结合凋亡细胞的形态学特征加以判断：凋亡细胞成单个或少数几个孤立地分布在组织中；凋亡细胞成单个或少数几个孤立地分布在组织中；具具有有凋凋亡亡细细胞胞的的核核特特征征，核核固固

39、缩缩，显显一一个个或或多多个个染染色色体团块，或凋亡小体；体团块，或凋亡小体；周围或局部无炎症反应周围或局部无炎症反应。第93页/共117页第94页/共117页三、流式细胞仪检测 flowcytometer（一）PI单染（二）Hoechst33342/PI双染色（三）Annexin/PI双染色第95页/共117页流式细胞仪流式细胞仪 flowcytometer荧光激活细胞分类器荧光激活细胞分类器 fluorescentactivatedcellsorter,FACSHoechst33342是双苯并咪唑家族成员，能特异性与DNA螺旋小沟中AT结合。它能被活细胞摄入，也能在摄入后被细胞排出。活细胞

40、对碘化丙锭（PI），溴化乙锭（EB）有拒染性，当细胞被这些染料着染，提示为晚期凋亡或坏死。第96页/共117页（一）PI单染细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。坏死细胞中，DNA可染性并不立即下降，甚至反而增加，可能是由于细胞坏死时部分DNA变性，引起更多的可染位点。原理：第97页/共117页 收集细胞，PBS洗涤冷70乙醇固定12h以上离心，PBS洗涤，400目筛网过滤PI（含RNase）染色 流

41、式细胞仪检测操作：第98页/共117页判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）AB第99页/共117页PI单染检测细胞周期改变细胞周期分析第100页/共117页（二）Hoechst33342/PI双染色染料配制：Hoechst33342：配10ug/ml,4避光保存。PI：5ug/ml,4避光保存。第101页/共117页原理：凋亡细胞膜在早期是完整的，但细胞膜的通透性已有增加，因此进入早期凋亡细胞的Hoechst比正常细胞多；而EB、PI等不能进入凋亡细胞。即正常细胞不经固定，对EB、PI是拒染的。而坏死细胞早期就被破坏，能被这些染料染色

42、。第102页/共117页操作：悬浮细胞Hoechst33342，终浓度1ug/ml,贴壁细胞消化后，培养液重悬，加Hoechst，37,7-10min，离心，洗涤，加PI，4避光15 min，400目滤网过滤，流式细胞仪检测。第103页/共117页结果判断：在双变量流式细胞仪散点图上 正常细胞Hoechst(-),PI(-)凋亡细胞Hoechst(+),PI(-)坏死细胞Hoechst(+),PI(+)第104页/共117页第105页/共117页（三）Annexin/PI双染色原理：磷脂酰丝氨酸（原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可

43、能是侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜膜内外转位酶的早期激活有关。内外转位酶的早期激活有关。Annexin是一种是一种Ca2依赖磷脂结合蛋白，对依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度亲和性。有高度亲和性。PSPS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细胞膜完整性受到破坏坏死细胞膜完整性受到破坏,可用可用PIPI区分。区分。第106页/共117页1.1.消化收集细胞，1000rpm离心6min，弃上清。2.2.加入1mL冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮

44、，离心，弃上清。3.3.加入1mL冷的1bindingbuffer，轻轻振荡使细胞悬浮，离心，弃上清。4.4.将细胞重悬于200L1bindingbuffer。5.5.加入10LAnnexin -FITC 和 5 5 L碘化丙锭（PI），轻轻混匀，室温避光反应15min。加入300L1bindingbuffer，立即上机检测。6.6.流式细胞仪CellQuest软件分析细胞凋亡和坏死的百分率。每个样本随机分析10000个细胞。操作：第107页/共117页检测标准：早期凋亡细胞：Annexin-FITC(+)；PI(-)；坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞：Annexin-FITC(+)；PI(+

45、)；机械性坏死及非特异性染色：Annexin-FITC(-)；PI(+)；正常细胞：Annexin-FITC(-)；PI(-)；第108页/共117页C-myc ASO200nmol/L 凋亡结果凋亡结果坏死结果坏死结果第109页/共117页第110页/共117页亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光（527nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590nm）.JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体的膜电位（）具有极性，JC-1依赖于的极性被迅速摄入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590nm，线粒体）和绿色荧光（527nm，胞液）.而细胞发生凋

46、亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，线粒体内红光强度减弱（590nm），以单体的形式存在于胞液内而发绿色荧光（527nm）.因此在双色滤光片下观察，正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红.第111页/共117页第112页/共117页第113页/共117页第114页/共117页Caspase3，6，7的检测第115页/共117页50.1 27.9 27.4ApoptosisoflivinASODNonHepG2cellsMTT inhibitory rates:77.510.47 livin ASODN on HepG2 cells 第116页/共117页感谢您的观看。第117页/共117页