实验一 大肠杆菌的分离和培养.pptx

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1、会计学1实验一实验一 大肠杆菌的分离和培养大肠杆菌的分离和培养实验目的：实验目的：n n1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。n n2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基本进行细菌的划线培养。n n3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。第1页/共25页一、基础知识一、基础知识一、基础知识一、基础知识n n(一一一一)微生物微生物微生物微生物:1.1.1.1.特点：结构都相当简单特点：结构都相当简单特点：结构都相当简单特点：结构都相当简单,个体多数十分微小个体多数十分微小个体多数十分微小个体多数十分微小.通常要通常要通常要通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没用

2、光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构有细胞结构有细胞结构有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素且体内一般不含有叶绿素且体内一般不含有叶绿素且体内一般不含有叶绿素.不能进行光不能进行光不能进行光不能进行光合作用合作用合作用合作用.2.微生物包括五类微生物包括五类病病 毒毒细细 菌菌放线菌放线菌真真 菌菌原生动物原生动物第2页/共25页(二二)培养培养基基n n1.分类(按物理形态按物理形态分分)n n(1)液体培养基液体培养基n n(2)固体培养基固体培养基常用的固体培养基常用的固体培养基:琼脂固

3、体培养基琼脂固体培养基.微生物在固体培养基微生物在固体培养基 表面生长表面生长,可以形成可以形成 肉眼可见的肉眼可见的菌落菌落.第3页/共25页2.2.培养基内所含的基本物质培养基内所含的基本物质培养基内所含的基本物质培养基内所含的基本物质n n(1)(1)水水n n(2)(2)碳源碳源 n n(3)(3)氮源氮源n n(4)(4)无机盐无机盐第4页/共25页3.3.培养基内所需的其他条件培养基内所需的其他条件培养基内所需的其他条件培养基内所需的其他条件n n(1)pH值n n如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性n n(2)特殊营养物质-?n n如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素n

4、 n(3)氧气的含量n n如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件生长因子生长因子第5页/共25页(三三)无菌技术无菌技术n n1 1、获得纯净培养物的关键、获得纯净培养物的关键、获得纯净培养物的关键、获得纯净培养物的关键:n n2 2、无菌技术、无菌技术、无菌技术、无菌技术 的的的的四个方面四个方面四个方面四个方面(参看教材参看教材参看教材参看教材2020页页页页)n n3 3、消毒与灭菌、消毒与灭菌、消毒与灭菌、消毒与灭菌(1)(1)消毒：消毒：消毒：消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物概念：使用

5、较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？芽孢和孢子吗？芽孢和孢子吗？芽孢和孢子吗？方法方法方法方法:a.a.煮沸消毒法煮沸消毒法煮沸消毒法煮沸消毒法b.b.巴氏消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒如牛奶的消毒如牛奶的消毒如牛奶的消毒c.c.化学药剂消毒化学药剂消毒化学药剂消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等

6、等等等d.d.紫外线消毒紫外线消毒紫外线消毒紫外线消毒(不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子)防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵第6页/共25页（2 2）灭菌）灭菌）灭菌）灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。的微生物，包括芽孢和孢子。的微生物，包括芽孢和孢子。的微生物，包括芽孢和孢子。方法：方法：方法：方法：a a 灼烧灭菌灼烧灭菌灼烧灭菌灼烧灭菌 b b 干热灭菌干热灭菌干热灭菌干热灭菌 c c 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭

7、菌a.灼烧灭菌灼烧灭菌微生物的接种工具微生物的接种工具(接接种环、接种针种环、接种针)或其或其他金属用具直接在他金属用具直接在火焰的充分燃烧层火焰的充分燃烧层灼烧灼烧注意适用范围注意适用范围第7页/共25页b.干热灭菌干热灭菌 160170；12h能耐高温的需要保持干能耐高温的需要保持干燥的物品燥的物品(玻璃器皿玻璃器皿)c.高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min通常用于培养基的灭菌通常用于培养基的灭菌第8页/共25页二、实验操作二、实验操作二、实验操作二、实验操作n n（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（

8、一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基n n计算称量溶化灭菌计算称量溶化灭菌计算称量溶化灭菌计算称量溶化灭菌倒平板倒平板倒平板倒平板n n（二）分离纯化大肠杆菌（二）分离纯化大肠杆菌（二）分离纯化大肠杆菌（二）分离纯化大肠杆菌n n接种方法有：接种方法有：接种方法有：接种方法有：n n划线分离法划线分离法划线分离法划线分离法和和和和涂布分离法涂布分离法涂布分离法涂布分离法n n（三）将接种后的培养基和一个未接（三）将接种后的培养基和一个未接（三）将接种后的培养基和一个未接（三）将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入种的培养基放入种的培养基放入种的培养基放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养恒温箱中培养

9、恒温箱中培养12h12h和和和和24h24h后，观察并记录后，观察并记录后，观察并记录后，观察并记录第9页/共25页三、课题延伸：菌种的保藏三、课题延伸：菌种的保藏n n1、斜面、斜面保藏保藏n n（临时保临时保存存）n n2、甘油、甘油保藏保藏 （长期保长期保存存）第10页/共25页实验实验1：大肠杆菌的培养和分离：大肠杆菌的培养和分离设备及用品：灭菌锅或高压锅、灭菌锅或高压锅、250ml250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径直径90mm90mm的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、

10、装养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管有酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管（15mm120mm15mm120mm）5 5支支实验材料：(1)50mlLB(1)50mlLB液体培养基：蛋白胨液体培养基：蛋白胨0.5g0.5g、酵母提取物、酵母提取物0.25g0.25g、NaCl 0.5gNaCl 0.5g、加水、加水50ml50ml。(2)(2)大肠杆菌菌种斜面大肠杆菌菌种斜面(3)(3)空白斜面空白斜面 第11页/共25页实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤n n(1)(1)灭菌灭菌灭菌灭菌：将配制好的：将配制好的50mlLB50mlLB液体培养基

11、和液体培养基和50mlLB50mlLB液体液体培养基分别装入两个培养基分别装入两个250ml250mln n的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。n n(2)(2)制平板制平板制平板制平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4 4个个培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平面。面。n n(3)(3)接种扩大培养接种扩大培养接种扩大培养接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在三角烧瓶的液体培养基

12、中，三角烧瓶在3737摇床振荡摇床振荡培养培养12h12h。n n(4)(4)划线分离划线分离划线分离划线分离：将摇床上培养：将摇床上培养12h12h的菌液在固体培养基的的菌液在固体培养基的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在3737恒温培养箱中进行培养。恒温培养箱中进行培养。n n(5)(5)单菌落接种培养单菌落接种培养单菌落接种培养单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在取出，再用划线法接种在空白斜面上，在3737下培养下培养24h,424h,4冰箱保存。冰箱保存。第12页/共25页单菌单菌落落第13页/共25页实验讨论实验讨论实验讨论实验讨论实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？n n实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可再用。第14页/共25页