实时荧光定量PCR技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门课件.pptx
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1、目录目录实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR基本原理基本原理实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的实验设计的实验设计实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR两种相对定量方法比较两种相对定量方法比较实时实时荧光定量荧光定量PCRPCR误差分析误差分析及操作规范及操作规范实验中污染的防实验中污染的防控控荧光定量荧光定量PCRPCR报告模板报告模板第1页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR基本原理基本原理第2页/共51页常规常规PCR:借助电泳对扩增反应的:借助电泳对扩增反应的终产物终产物进行半进行半定定量及量及定性定性分析。分析。定量定量PCR技术:利用技术:利用荧光信号的变化实时检测荧光信
2、号的变化实时检测PCRPCR扩扩增反应中增反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化,最终精确,最终精确的对的对起始起始模板进行模板进行定量分析。定量分析。常规常规vs vs实时实时第3页/共51页优缺点优缺点比较比较第4页/共51页定量定量PCRPCR三个基本概念三个基本概念(1)扩增曲线PCR过程中,以循环数为横坐标,以反应过程中荧光强度为纵坐标所做的曲线。第5页/共51页定量定量PCRPCR三个基本概念三个基本概念(2)阈值的概念在荧光定量PCR扩增的指数期,画一条线,在此直线上,所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。第6页/共51页定量定量PCRPCR三个基
3、本概念三个基本概念(3)CT值PCR过程中,各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时,所经过的扩增循环数。第7页/共51页C(t)C(t)与初始模板含量与初始模板含量初始模板量越多,C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210第8页/共51页荧光定量荧光定量PCRPCR的定量的定量原理原理浓度的对数值浓度的对数值与与循环循环数数呈线性关系,根据呈线性关系,根据样品扩增达到域值的样品扩增达到域值的循环数(循环数(Ct值)就可值)就可分析样品中起始模板
4、分析样品中起始模板量。量。第9页/共51页荧光定量荧光定量PCRPCR的化学原理的化学原理 化学化学方法分类方法分类非特异性非特异性SYBR Green I法法特异性特异性TaqMan探针法探针法第10页/共51页SYBR Green ISYBR Green I法法原理:原理:结合结合双链双链DNADNA分子小沟分子小沟延伸结束,形成双链延伸结束,形成双链DNADNA,SYBR GreenSYBR Green结结合到双螺旋小沟中,当受到适合光源激发,合到双螺旋小沟中,当受到适合光源激发,发射出荧光,反映产物浓度发射出荧光,反映产物浓度优点优点使用方便,无需复杂的设计使用方便,无需复杂的设计成本
5、较低成本较低缺点缺点与非特异性产物结合,无模板特异性与非特异性产物结合,无模板特异性试验方法较难优化试验方法较难优化灵敏度低灵敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第11页/共51页第12页/共51页SYBR Green ISYBR Green I法法溶解曲线分析溶解曲线分析第13页/共51页荧光染料的特点及荧光染料的特点及应用应用(1)、能够与所有的核酸双链结合,受激后产生荧光,其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比,因此本底较高;(2)、可做双链核酸的熔解曲线分析;(3)、SYBR Green染料本身价格便宜,但是做荧光定量PCR时对引物设计的要求
6、很高;对Taq酶要求较高,最好是HotStar Taq酶,或者操作时需要严格的冷启动,冰上操作,否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性,尤其是模板含量较低时;(4)、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛;(5)、在分析的基因种类很多,但是样品量很少时,尤其适用。(6)、对PCR反应的毒性,能抑制PCR反应,降低PCR反应的效率。第14页/共51页TaqManTaqMan探针法探针法水解型水解型报告基团,淬灭基团报告基团,淬灭基团FRETFRET(荧光谐振能量传递)(荧光谐振能量传递)识别特异性产物识别特异性产物优点优点特异性高,可准确定量特异性高,可准确定量灵敏度高灵敏度高
7、设计不同标记的探针,可设计不同标记的探针,可进行多重检测进行多重检测缺点缺点一个探针只适用于一个目一个探针只适用于一个目标标价格较高价格较高探针设计较繁琐探针设计较繁琐第15页/共51页第16页/共51页TaqManTaqMan作用机理作用机理第17页/共51页两种化学的比较两种化学的比较第18页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的实验设计的实验设计第19页/共51页绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量:精确的计算初始反应的模板浓度绝对定量:精确的计算初始反应的模板浓度(DNADNA,RNARNA)相对定量:计算初始反应模板的相对含量相对定量:计算初始反应模板的相对含量第2
8、0页/共51页定量定量PCR-PCR-绝对定量绝对定量标准品,标准曲线标准品,标准曲线已知浓度的相应已知浓度的相应DNADNA模板,按不同浓度稀释模板,按不同浓度稀释根据实时根据实时PCRPCR反应得到相应的反应得到相应的C(t)C(t),构建标准曲线,构建标准曲线样品样品与标准品同时进行与标准品同时进行PCRPCR反应得到未知浓度样品的反应得到未知浓度样品的C(t)C(t)值值第21页/共51页定量定量PCR-PCR-相对定量相对定量相对定量的目的相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异(倍数关系)比较基因在不同情况下的表达差异(倍数关系)相对定量的问题相对定量的问题样品材料不均一造成的
9、差别样品材料不均一造成的差别内标基因内标基因内标通常是内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因(内标基因的表达要等看家基因(内标基因的表达要相对恒定,表达不受处理因素影响)相对恒定,表达不受处理因素影响)对目的基因进行均一化:去除样本间加样量不同带来的误差对目的基因进行均一化:去除样本间加样量不同带来的误差第22页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR两种相对两种相对定定量量方法比较方法比较相对标准曲线相对标准曲线法和法和2-c(t)法法第23页/共51页相对标准曲线法相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线标
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