实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.pptx
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1、实验二实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳一、实验目的与要求了解电泳技术的一般原理了解电泳技术的一般原理学习醋酸纤维素薄膜电泳操作技术学习醋酸纤维素薄膜电泳操作技术测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量第1页/共16页二、实验原理1.1.1.1.电泳电泳电泳电泳 是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定在一定在一定在一定pHpHpHpH条件下,不同的蛋
2、白质由于具有不同的等电点而带不同条件下,不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同条件下,不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同条件下,不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不性质的电荷,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不性质的电荷,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不性质的电荷,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同,即它们的电泳迁移率不同,因此,可使它们分离同,即它们的电泳迁移率不同,因此,可使它们分离同,即它们的电泳迁移率不同,因此,可使它们分离同,即它们的电泳迁移率不同,因此,可使它们分离2.2.
3、2.2.影响电泳迁移率的因素:影响电泳迁移率的因素:影响电泳迁移率的因素:影响电泳迁移率的因素:内在因素:内在因素:内在因素:内在因素:蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状 外界因素:外界因素:外界因素:外界因素:电场强度、溶液的电场强度、溶液的电场强度、溶液的电场强度、溶液的pHpHpHpH值、溶液的离子强度和电渗现象值、溶液的离子强度和电渗现象值、溶液的离子强度和电渗现象值、溶液的离子强度和电渗现象3.3.3.3.醋酸纤维素溶于有机溶剂(如:丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)醋酸纤维素
4、溶于有机溶剂(如:丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)醋酸纤维素溶于有机溶剂(如:丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)醋酸纤维素溶于有机溶剂(如:丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构,厚度约为沫状的结构,厚度约为沫状的结构,厚度约为沫状的结构,厚度约为120 120 120 120 m m m m,有很强的通透性,对分子移动阻力,有很强的通透性,对分子移动阻力,有很强
5、的通透性,对分子移动阻力,有很强的通透性,对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高,对样品无拖很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高,对样品无拖很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高,对样品无拖很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高,对样品无拖尾和吸附现象等优点尾和吸附现象等优点尾和吸附现象等优点尾和吸附现象等优点第2页/共16页4.4.4.4.经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5 5 5 5条区带,条
6、区带,条区带,条区带,从正极端依次为清蛋白、从正极端依次为清蛋白、从正极端依次为清蛋白、从正极端依次为清蛋白、1111球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、2222球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白及球蛋白及球蛋白及球蛋白及球蛋白,经染色可计算出各蛋白质的百分含量。球蛋白,经染色可计算出各蛋白质的百分含量。球蛋白,经染色可计算出各蛋白质的百分含量。球蛋白,经染色可计算出各蛋白质的百分含量。第3页/共16页三、实验器材1.DYY-6C1.DYY-6C型型型型 双稳定时电泳仪和双稳定时电泳仪和双稳定时电泳仪和双稳定时电泳仪和DYY-DYY-型电泳槽,均为北京市六型电泳槽,均为北京市六型电泳槽,均为北
7、京市六型电泳槽,均为北京市六一仪器厂生产一仪器厂生产一仪器厂生产一仪器厂生产2.2.醋酸纤维薄膜(醋酸纤维薄膜(醋酸纤维薄膜(醋酸纤维薄膜(2cm8cm2cm8cm)3.3.培养皿:一排桌子公用培养皿:一排桌子公用培养皿:一排桌子公用培养皿:一排桌子公用5 5套,包括套,包括套,包括套,包括平衡、染色各用一套,漂洗用平衡、染色各用一套,漂洗用平衡、染色各用一套,漂洗用平衡、染色各用一套,漂洗用3 3套。套。套。套。4.4.点样器点样器点样器点样器5.5.滤纸滤纸滤纸滤纸 6.6.载玻片载玻片载玻片载玻片7.7.镊子镊子镊子镊子8.8.玻棒玻棒玻棒玻棒第4页/共16页四、实验试剂1.1.1.1.
8、巴比妥巴比妥巴比妥巴比妥-巴比妥纳缓冲液巴比妥纳缓冲液巴比妥纳缓冲液巴比妥纳缓冲液(pH8.6(pH8.6(pH8.6(pH8.6,0.07mol/L0.07mol/L0.07mol/L0.07mol/L,离子强度,离子强度,离子强度,离子强度0.06)0.06)0.06)0.06)称取称取称取称取1.66g1.66g1.66g1.66g巴比妥巴比妥巴比妥巴比妥(AR)(AR)(AR)(AR)和和和和12.76g12.76g12.76g12.76g巴比妥纳巴比妥纳巴比妥纳巴比妥纳(AR)(AR)(AR)(AR),置于三角烧,置于三角烧,置于三角烧,置于三角烧瓶中,加蒸馏水约瓶中,加蒸馏水约瓶中
9、,加蒸馏水约瓶中,加蒸馏水约600ml600ml600ml600ml,稍加热溶解,冷却后用蒸馏水定容至,稍加热溶解,冷却后用蒸馏水定容至,稍加热溶解,冷却后用蒸馏水定容至,稍加热溶解,冷却后用蒸馏水定容至1000ml1000ml1000ml1000ml,置,置,置,置4444保存,备用。保存,备用。保存,备用。保存,备用。2.2.2.2.血清蛋白染色血清蛋白染色血清蛋白染色血清蛋白染色(1)(1)(1)(1)染色液染色液染色液染色液(0.5(0.5(0.5(0.5氨基黑氨基黑氨基黑氨基黑10B)10B)10B)10B):称取:称取:称取:称取0.5g0.5g0.5g0.5g氨基黑氨基黑氨基黑氨
10、基黑10B10B10B10B,加蒸馏水,加蒸馏水,加蒸馏水,加蒸馏水40ml40ml40ml40ml,甲醇,甲醇,甲醇,甲醇(AR)50ml(AR)50ml(AR)50ml(AR)50ml,冰乙酸,冰乙酸,冰乙酸,冰乙酸(AR)10ml(AR)10ml(AR)10ml(AR)10ml,混匀溶解后置具塞试剂瓶,混匀溶解后置具塞试剂瓶,混匀溶解后置具塞试剂瓶,混匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。内贮存。内贮存。内贮存。(2)(2)(2)(2)漂洗液:取漂洗液:取漂洗液:取漂洗液:取95959595乙醇乙醇乙醇乙醇(AR)45ml(AR)45ml(AR)45ml(AR)45ml,冰乙酸,冰乙酸,冰乙酸,冰
11、乙酸(AR)5ml(AR)5ml(AR)5ml(AR)5ml,和蒸馏水,和蒸馏水,和蒸馏水,和蒸馏水50ml50ml50ml50ml,混匀置具塞试剂瓶中贮存。,混匀置具塞试剂瓶中贮存。,混匀置具塞试剂瓶中贮存。,混匀置具塞试剂瓶中贮存。第5页/共16页五、测试材料未溶血的人或动物血清第6页/共16页电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成,两者之间有专门的电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成,两者之间有专门的电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成,两者之间有专门的电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成,两者之间有专门的连线连接。稳压电源用于调节电压和通电时间。当电泳槽和稳连线连接。稳压电源用于调节电压和通电时
12、间。当电泳槽和稳连线连接。稳压电源用于调节电压和通电时间。当电泳槽和稳连线连接。稳压电源用于调节电压和通电时间。当电泳槽和稳压电源连接好后,将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上,盖压电源连接好后,将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上,盖压电源连接好后,将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上,盖压电源连接好后,将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上,盖上盖子,通电,调整好电压,进行电泳。注意电泳槽的电极方上盖子,通电,调整好电压,进行电泳。注意电泳槽的电极方上盖子,通电,调整好电压,进行电泳。注意电泳槽的电极方上盖子,通电,调整好电压,进行电泳。注意电泳槽的电极方向,负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧
13、。目前,该向,负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。目前,该向,负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。目前,该向,负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。目前,该电泳仪已改进为数显式的电泳仪已改进为数显式的电泳仪已改进为数显式的电泳仪已改进为数显式的DYY-6CDYY-6CDYY-6CDYY-6C型。型。型。型。浸泡:将浸泡:将浸泡:将浸泡:将28 cm28 cm28 cm28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端在无光泽面距短边一端在无
14、光泽面距短边一端在无光泽面距短边一端1.5 cm1.5 cm1.5 cm1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线,将处用铅笔轻轻画一条点样线,将处用铅笔轻轻画一条点样线,将处用铅笔轻轻画一条点样线,将之置于盛有缓冲液的平皿中,浸泡之置于盛有缓冲液的平皿中,浸泡之置于盛有缓冲液的平皿中,浸泡之置于盛有缓冲液的平皿中,浸泡30 min30 min30 min30 min方可用于点样。方可用于点样。方可用于点样。方可用于点样。点样:用镊子取出浸透的薄膜,夹在两层粗滤纸内吸干多余的点样:用镊子取出浸透的薄膜,夹在两层粗滤纸内吸干多余的点样:用镊子取出浸透的薄膜,夹在两层粗滤纸内吸干多余的点样:用镊子取出浸
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