数字学习教案.pptx

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1、会计学1数字数字(shz)第一页，共32页。DigitalPCR什么是Digital PCR？数字PCR 本质上是把弱信号从噪音(zoyn)信号中“拎”出来。第2页/共32页第二页，共32页。DigitalPCR技术(jsh)原理数字PCR一般包括两部分内容,即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段,数字PCR先将样品稀释到单分子水平,再平均分配到几十至几万个单元中进行反应(fnyng)。与qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不同,数字PCR是在扩增结束后对每个反应(fnyng)单元的荧光信号进行采集,有荧光信号记为1,无荧光信号记为0,有荧光信号的反应(fnyng)单元中至少包含一个

2、拷贝的。第3页/共32页第三页，共32页。DigitalPCR技术(jsh)原理第4页/共32页第四页，共32页。DigitalPCR技术(jsh)原理在通常情况下,数字PCR的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,这时需要采用泊松概率分布公式(Poissondistribution)进行(jnxng)计算上式中为每个反应单元中所含目标DNA分子的平均拷贝数(浓度),p为在一定的条件下,每个反应单元中所含k个拷贝目标DNA分子的概率。由样品的稀释倍数m决定,有=cm,其中c为样品的原始拷贝数(浓度)。当k=0(不含目标DNA分子)时,上式可简化为p=e=ecm,p可以看作是无荧光信号的反

3、应单元数与反应单元总数(zngsh)的比值,即其中,n为反应单元总数(zngsh),f为有荧光信号的反应单元数。上式两边取对数(ln)得到，根据数字PCR反应单元总数(zngsh)和有荧光信号的单元数以及样品的稀释倍系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。第5页/共32页第五页，共32页。DigitalPCR第6页/共32页第六页，共32页。最初Vogelstein等提出的数字PCR是在96孔板中进行(jnxng)的。DNA模板被稀释成大约平均每两个孔内有一个拷贝的浓度，在经过优化的实验条件下进行(jnxng)PCR扩增。DigitalPCR94 1min94 15s55 15s70 15s

4、70 5min60循环(xnhun)PCR扩增第7页/共32页第七页，共32页。他们设计了两种带有不同荧光基团的分子信标探针分别(fnbi)与PCR产物杂交，其中一种探针可以与野生型和突变型两种产物杂交，另一种探针只与野生型杂交，通过直接计数每个孔内的荧光信号得到同一样品中等位基因(或野生型与突变型)的数目和比值，并利用统计学方法分析样品间的显著性差异。第8页/共32页第八页，共32页。FIG.2.DiscriminationbetweenWTandmutantPCRproductsbyMBs.SeparatePCRproducts(n=10),eachgeneratedfrom50genom

5、eequivalentsofDNAofcolorectaltumorcellscontainingtheindicatedmutationsofc-Ki-Ras,wereanalyzedwiththeMBprobesdescribedabove.RepresentativeexamplesofthePCRproductsusedforMBanalysiswerepurifiedandsequenceddirectly.第9页/共32页第九页，共32页。DigitalPCRKinzler和Vogelstein 检测和量化直肠癌患者粪便样品中的K-RAS突变，因此将基因组DNA稀释并等分至384孔

6、微量滴定板的各个孔中，这样整个(zhngg)板就代表了单个样品。他们随后扩增了包含所寻找的突变热点的基因区域。第10页/共32页第十页，共32页。DigitalPCR发展(fzhn)历史1992年，Sykes等报道了基于样品稀释和泊松分布数据处理的巢式PCR定量技术，并提出了数字PCR的构想。1997年Kalinina,、BrownJ,和SilverJ使用纳升级芯片进行单克隆模板PCR扩增，获得(hud)了美国专利，更重要的是这种采用“电浸润法”进行纳升级芯片制造技术显露雏形。1999年,Vogelstein和Kinzler首次提出了数字PCR。2003年Dressman等发明了一种BEAMi

7、ng方法(珠子、乳剂、扩增与磁力)BEAMing将模板、引物、PCR试剂和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多数的小滴不含有或只含有一个模板。PCR完成后，其中扩增产物会通过生物素链酶亲和素的键合关联在磁珠上，乳化物随之会被打散，珠子就能通过与检测寡核苷酸和流式细胞仪的杂交物所读取。第11页/共32页第十一页，共32页。DigitalPCR发展(fzhn)历史2006年Fluidigm公司推出了第一台基于芯片的商品化数字PCR系统.QuantaLife利用油包水微滴生成(shnchn)技术开发了微滴式数字PCR技术.2011年，QuantaLife公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪

8、产品更名为QX100型号仪,2013年该公司又推出了升级型号QX200.2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio3D数字PCR系统第12页/共32页第十二页，共32页。DigitalPCR分类(fnli)微反应(fnyng)室/孔板数字PCR 早期的数字PCR技术采用96/384孔板作为反应(fnyng)单元。但是数字PCR技术的灵敏度取决于反应(fnyng)单元的总数,反应(fnyng)单元数越多越有利于提高灵敏度和准确度,普通的96/384孔板无法满足检测的需要。因此,出现了成倍提高反应(fnyng)单元数目的做法,反应(fnyng)体积从微升降至纳

9、升级。第13页/共32页第十三页，共32页。DigitalPCR分类(fnli)微流控芯片数字PCR 微流控芯片技术的使用使数字PCR能够快速并准确地将样品流体分成若干个独立的单元,进行多步平行反应、成本低、体积小和高通量,是理想的数字PCR平台。目前Fluidigm公司的Bio-Mark TM 基因(jyn)分析系统，Life Technologies公司QuantStudio TM 3D数字 PCR系统均均为采用微流控芯片技术的数字PCR系统。第14页/共32页第十四页，共32页。DigitalPCR-QuantStudioTM3D数字(shz)可可获获得得兼兼具具高高精精确确度度和和高高

10、敏敏感感度度的的绝绝对对定定量量数数据据可以进行单分子监测和计数。可以进行单分子监测和计数。工工作作流流程程简简单单基基于于芯芯片片的的工工作作流流程程。只只需需载载入入芯芯片并运行即可获得数据。片并运行即可获得数据。经经济济的的处处理理平平台台以以较较低低的的采采购购和和运运行行成成本本立立即即开开展数字展数字PCRPCR。兼兼容容性性强强使使用用您您的的现现有有TaqMan TaqMan AssayAssay方方法法即即可可获得数字化结果。获得数字化结果。密密封封的的系系统统通通过过密密封封芯芯片片隔隔绝绝任任污污染染物物，无无需需转转移移(zhuny)(zhuny)步骤，避免样品暴露。步

11、骤，避免样品暴露。宽动态范围宽动态范围可实现可实现5 Log5 Log的动态范围。的动态范围。直直观观可可在在仪仪器器触触摸摸屏屏上上直直接接看看到到数数据据，也也可可以以轻轻松松地地将将数数据据转转移移(zhuny)(zhuny)到到计计算算机机上上，采采用用AnalysisSuiteAnalysisSuite数字数字PCRPCR软件进行分析。软件进行分析。第15页/共32页第十五页，共32页。DigitalPCR分类(fnli)液滴数字 PCR 液滴数字PCR源于乳液PCR(emulsion PCR)技术，利用微滴发生器可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴,作为数字

12、PCR的样品(yngpn)分散载体。PCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。目前Bio-Rad公司的QX100系统、QX200系统均为采用液滴技术的数字PCR系统。第16页/共32页第十六页，共32页。DigitalPCR分类(fnli)之BIO-RAD液滴式数字PCR第17页/共32页第十七页，共32页。DigitalPCR之BIO-RAD液滴式数字(shz)PCR第18页/共32页第十八页，共32页。DigitalPCR分类(fnli)之BIO-RAD液滴式数字PCR第19页/共32页第十九页，共32页。DigitalPCR分类(fnli)之BIO-RAD液滴式数字PCR第20页/共32页

13、第二十页，共32页。DigitalPCR优点(yudin)qPCRdPCR每个循环进行实时荧光测定扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集样品的PCR 扩增效率可能与校准物的扩增效率不同直接计数目标分子数而不依靠任何校准物或外标低拷贝数的目标DNA 分子不能通过扩增检测到单DNA 模板出现在反应室而未被检出可能性非常低qPCR 主要依赖于校准物制备的标准曲线，进而确定未知样品的浓度，是相对定量的方法通过计数单个分子从而实现绝对定量第21页/共32页第二十一页，共32页。DigitalPCR应用(yngyng)产前诊断1997年卢煜明教授课题组发现孕妇(ynf)血浆中的胎儿游离核酸(DNA 和

14、 RNA)检测开启了无创产前诊断的新领域，补充了唐氏综合症(非侵入性染色体异倍体)产前诊断方法。检测孕妇(ynf)血液中完全来自胎儿的PLAC4 mRNA 上的SNP 位点(rs8130833)的比例(digital-RNA-SNP 法)，以及检测血液中21 号染色体与1 号染色体的相对含量(digital RCD 法)，可检测血液中25%的胎儿基因。第22页/共32页第二十二页，共32页。DigitalPCR应用(yngyng)二代测序下一代测序(next generation sequencing,NGS)需要通过测序校正分子数量，文库制备需要微克级的样本核酸，对样本量要求较高。dPCR

15、实现了测序文库的绝对定量，消除了构建和 PCR 定量标准曲线等不确定(qudng)因素，相对标准偏差低于 10%，在无滴定情况下，足够满足直接测序的精度要求。第23页/共32页第二十三页，共32页。DigitalPCR应用(yngyng)肿瘤早期研究1、检测稀有突变(tbin)：以dPCR法来检测肺癌患者痰液中基因的突变(tbin)，使用dPCR 在EGF 突变(tbin)患者中有30%50%可以在痰液中检测出EGFR（表面生长因子）突变(tbin)，这与在血液中检出率相似，表明使用dPCR 对痰液的检测可代替某些病人的活检，dPCR 还应用于通过其他体液，以非侵入性的方式诊断肿瘤。第24页/

16、共32页第二十四页，共32页。DigitalPCR应用(yngyng)2、miRNA 精确定量miRNA是一类(y li)内源性的具有调控功能的非编码RNA，他们参与调节细胞功能，并且稳定的存在于外周循环，可发展为癌症早期检测的生物标志物。dPCR可以用于血液样品miRNA的分析测试。第25页/共32页第二十五页，共32页。DigitalPCR应用(yngyng)3、拷贝数变异研究拷贝数变异(copynumbervariations，CNVs)是指基因组的缺失，扩增和易位，长度从数百到数百万个碱基对不等，可能导致疾病的易感性。使用dPCR目标基因被确定后，用限制性内切酶来分离目标基因，每个模板

17、稀释到独立的微滴然后分别计数，可以获得极高的精度。拷贝数变异对肿瘤的发生发展起着一定的作用，有研究对乳腺癌的拷贝数变异和易感性的关系(gunx)进行报道，总共分析了7个相关CNVs，第26页/共32页第二十六页，共32页。DigitalPCR应用(yngyng)环境微生物方向快速诊断细菌，由于dPCR灵敏度更高，因此不经细菌培养就可对样品直接进行鉴定。采用多种细菌的通用(tngyng)引物进行多重PCR分析，还可提高通量，节约成本，实现快速诊断。第27页/共32页第二十七页，共32页。DigitalPCR应用(yngyng)多重PCR实现快速诊断 在对突发或不明原因感染进行确诊时，需对样本进行

18、大规模选择性地筛查，如在同一反应体系中进行多重反应和定量多种目的片段，在保证荧光信号强度与探针浓度成正比的前提下，调整荧光素的浓度以及调整两种荧光素混合时的配比，可以在一个(y)反应中达到多至10重的分析。第28页/共32页第二十八页，共32页。DigitalPCR前景(qinjng)dPCR目前主要用于原癌基因的等位基因突变、微小RNA分析和拷贝数变异，其在传染病领域也有广阔的应用前景，在病原学诊断、抗病毒治疗监测、预后判断等方面具有重要意义。许多公司正在研发一步法试剂盒，或者在芯片(xnpin)中整合反转录反应，能够直接特异检测RNA分子，将拓宽其在传染病临床诊断和基因表达研究中的应用。d

19、PCR正朝着高通量、低成本、低样本损耗的方向发展，或将成为基础研究和临床诊断领域的主流技术。第29页/共32页第二十九页，共32页。参考文献1 Vogelstein B,Kinzler K W.Digital PCR.J.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1999,96(16):9236-9241.2 李亮,隋志伟,王晶,等.基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展J.生物化学与生物物理进展,2012,10期(10):1017-1023.3 李春勇.数字PCR技术原

20、理及应用J.生物技术世界(shji),2014,(11):10-13.4 Jeffrey M.Perkel,高大海,姜天海.数字PCR革命J.科学新闻,2014,(08):72-75.5 Isaac K,Jian W,Nick P,et al.Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.J.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(23):9

21、530-9535.第30页/共32页第三十页，共32页。参考文献6 Wang P,Jing F,Li G,et al.Absolute quantification of lung Cancer related microRNA by droplet digital PCRJ.Biosensors&Bioelectronics,2015,74:836-842.7 王青,刘宝瑞.液滴数字PCR在肿瘤个体化治疗方面的应用J.现代(xindi)肿瘤医学,2015,(12):1771-1774.8 胡伟,陈荣华,张晨,等.微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量J.法医学杂志,2014,30(5):342-345.9 林彩琴,姚波.数字PCR技术进展J.化学进展,2012,(12):2415-2423.第31页/共32页第三十一页，共32页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)！第32页/共32页第三十二页，共32页。