第五章 蛋白质的修饰.ppt

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1、第五章第五章 蛋白质的修饰蛋白质的修饰 蛋白质的修饰主要包括两个方面：蛋白质的修饰主要包括两个方面：（1 1）蛋白质分子的侧链基团的改变（化学）蛋白质分子的侧链基团的改变（化学修饰）。修饰）。（2 2）蛋白质分子中主链结构的改变（采取）蛋白质分子中主链结构的改变（采取基因工程的手段，定点突变是改变蛋白质主基因工程的手段，定点突变是改变蛋白质主链结构的常规操作）。链结构的常规操作）。第一节第一节 蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰是指蛋白质分子蛋白质的化学修饰是指蛋白质分子化学结构的改变。化学结构的改变。修饰的目的用于修饰的目的用于生物医学生物医学和和生物技术生物技术方面方面 修饰

2、反应条件：修饰反应条件：1 1、不引起蛋白质的不可逆变性、不引起蛋白质的不可逆变性2 2、有利于选择性地修饰蛋白质、有利于选择性地修饰蛋白质为此，要控制反应物配比、为此，要控制反应物配比、pHpH、反应温度反应温度、反应介质。反应介质。pHpH：最重要的条件。一般，增加：最重要的条件。一般，增加pHpH，可提，可提高反应速率，降低高反应速率，降低pHpH，可减小反应速率；，可减小反应速率；反应活性高的修饰剂可在生理反应活性高的修饰剂可在生理pHpH下与蛋白下与蛋白质耦合，反应活性低的修饰剂需提高质耦合，反应活性低的修饰剂需提高pHpH。T T：影响巯基的微环境；适宜的：影响巯基的微环境；适宜的

3、T T可减少或防可减少或防止竞争的基团的反应；对于热敏性蛋白，需止竞争的基团的反应；对于热敏性蛋白，需要在较低的要在较低的T T下进行反应。下进行反应。一、蛋白质侧链基团的修饰反应一、蛋白质侧链基团的修饰反应通过通过选择性试剂选择性试剂或或亲和标记试剂亲和标记试剂与蛋白质分与蛋白质分子侧链上的特定功能基团发生化学反应。子侧链上的特定功能基团发生化学反应。酰化及其相关反应酰化及其相关反应 烷基化反应烷基化反应 氧化还原反应氧化还原反应 芳香环取代反应芳香环取代反应 （1 1）酰化及其相关反应）酰化及其相关反应 这类化学修饰剂为乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸这类化学修饰剂为乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、

4、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-O-甲基异脲等，它甲基异脲等，它们在室温，们在室温，pH4.59条件下可与蛋白质分子侧链的氨条件下可与蛋白质分子侧链的氨基、羟基、巯基及酚基发生酰基化反应。基、羟基、巯基及酚基发生酰基化反应。1 1、蛋白质修饰反应的类型、蛋白质修饰反应的类型 （2 2）烷基化反应）烷基化反应 修饰剂常带有活泼的卤素原子，很容易使蛋白质修饰剂常带有活泼的卤素原子，很容易使蛋白质分子的亲核基团如氨基、巯基、羧基、硫醚基和分子的亲核基团如氨基、巯基、羧基、硫醚基和咪唑基发生烷基化，这类试剂有咪唑基发生烷基化，这类试剂有2 2，4-4-二硝基氟苯、二硝基氟

5、苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤化物和碘甲烷碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤化物和碘甲烷等。等。（3 3）氧化和还原反应）氧化和还原反应 如如H2O2H2O2、N-N-溴代琥珀酰亚胺能将侧链基团氧化，溴代琥珀酰亚胺能将侧链基团氧化，易受氧化的侧链基团有巯基、硫醚基、吲哚基、易受氧化的侧链基团有巯基、硫醚基、吲哚基、咪唑基以及酚基等。咪唑基以及酚基等。还原剂主要作用于二硫键，如还原剂主要作用于二硫键，如2-2-巯基乙醇、巯基巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇（乙酸和二硫苏糖醇（DTTDTT）等。）等。（4 4）芳香环取代反应）芳香环取代反应 氨基酸残基的酚羟基在氨基酸残基的酚羟基在3 3和和5 5位

6、上很容易发生亲电取位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应，如四硝基甲烷可以作用于酪代的碘化和硝化反应，如四硝基甲烷可以作用于酪氨酸的酚羟基，形成氨酸的酚羟基，形成3-3-硝基酪氨酸的衍生物，这种硝基酪氨酸的衍生物，这种产物有特殊的光谱，可用于直接定量测定。产物有特殊的光谱，可用于直接定量测定。2 2、各种侧链的化学修饰、各种侧链的化学修饰 巯基的化学修饰巯基的化学修饰 氨基的化学修饰氨基的化学修饰 羧基的化学修饰羧基的化学修饰 吲哚基的化学修饰吲哚基的化学修饰 酚羟基的化学修饰酚羟基的化学修饰 胍基的化学修饰胍基的化学修饰 1 1、巯基的化学修饰、巯基的化学修饰是蛋白质分子中最容易反应的侧链基

7、团。是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。烷基化试剂烷基化试剂特别是碘乙酸和碘乙酰胺，在蛋白质特别是碘乙酸和碘乙酰胺，在蛋白质的氨基酸组成分析和测序前，通常要用碘乙酸来使巯的氨基酸组成分析和测序前，通常要用碘乙酸来使巯基羧甲基化，防止半胱氨酸的降解，而且羧甲基化的基羧甲基化，防止半胱氨酸的降解，而且羧甲基化的半胱氨酸很容易被氨基酸分析仪所识别。半胱氨酸很容易被氨基酸分析仪所识别。N-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺修饰反应具有较强专一性并伴随修饰反应具有较强专一性并伴随光吸收的变化，可以通过光吸收的变化确定反应的程度。光吸收的变化，可以通过光吸收的变化确定反应的程度。5 5，5 5-二硫二硫-2

8、-2-硝基苯甲酸（硝基苯甲酸（DNTBDNTB）是目前最常用是目前最常用的巯基修饰试剂，与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分的巯基修饰试剂，与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记一个子上标记一个2-2-硝基硝基-5-5-硫苯甲酸（硫苯甲酸（TNBTNB），同时释放一），同时释放一个有很强衍射的个有很强衍射的TNBTNB阴离子，该阴离子在阴离子，该阴离子在412nm412nm具有很强具有很强的吸收，可以通过光吸收的变化来监测反应程度。的吸收，可以通过光吸收的变化来监测反应程度。2 2、氨基的化学修饰、氨基的化学修饰赖氨酸赖氨酸-氨基：三硝基苯磺酸（氨基：三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）就是）就是其

9、中非常有效的一种，其中非常有效的一种，TNBSTNBS与赖氨酸残基反应，与赖氨酸残基反应，在在420nm420nm和和367nm367nm能够产生特定的光吸收。能够产生特定的光吸收。在蛋白质序列分析中，首先必须测定整个肽链在蛋白质序列分析中，首先必须测定整个肽链的的N-N-末端和末端和C-C-末端残基，用于多肽链末端残基，用于多肽链N-N-末端残末端残基的测定的化学修饰方法常用：基的测定的化学修饰方法常用：2 2，4-4-二硝基二硝基氟苯法、丹磺酰氯法、苯异硫氰酸酯法。氟苯法、丹磺酰氯法、苯异硫氰酸酯法。3 3、羧基的化学修饰、羧基的化学修饰 蛋白质分子中谷氨酸和天冬氨酸含有羧基，蛋白质分子中

10、谷氨酸和天冬氨酸含有羧基，羧基修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰羧基修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。胺类。水溶性的水溶性的碳化二亚胺类碳化二亚胺类特定修饰蛋白质特定修饰蛋白质分子的羧基基团，可以在比较温和的条件下分子的羧基基团，可以在比较温和的条件下进行，目前已成为一种应用最普遍的标准方进行，目前已成为一种应用最普遍的标准方法。法。二、蛋白质位点专一性修饰二、蛋白质位点专一性修饰蛋白质修饰专一性：蛋白质修饰专一性：基团修饰专一性：基团修饰专一性：位点修饰专一性：位点修饰专一性：基团专一性与位点专一性的区别基团专一性与位点专一性的区别基团专一性试剂基团专一性试剂不仅可与活性部不仅可与活性

11、部位的基团发生反位的基团发生反应，也可以与活应，也可以与活性部位以外的基性部位以外的基团发生反应。团发生反应。亲和标记试剂只亲和标记试剂只专一性作用于蛋专一性作用于蛋白质的特定部位白质的特定部位如活性部位的侧如活性部位的侧链基团。链基团。蛋白质修饰专一性：蛋白质修饰专一性：基团修饰专一性：基团修饰专一性：位点修饰专一性：位点修饰专一性：试剂对被修饰的试剂对被修饰的基团基团的专一性的专一性 试剂对蛋白质分子中被修饰的试剂对蛋白质分子中被修饰的部位部位，如酶的活性部位、膜蛋，如酶的活性部位、膜蛋白质上的激素结合部位等位点白质上的激素结合部位等位点的专一性的专一性亲和标记亲和标记 亲和标记：亲和标记

12、：试剂对蛋白质分子中被修饰的部位试剂对蛋白质分子中被修饰的部位的专一性修饰，称为亲和标记或专一性的不可的专一性修饰，称为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用。逆抑制作用。亲和标记试剂，不仅具有对被作用基团的亲和标记试剂，不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性，即专一性，而且具有对被作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位的某一基团，而不与被试剂作用于被作用部位的某一基团，而不与被作用部位以外的同类基团发生作用。这类修饰作用部位以外的同类基团发生作用。这类修饰试剂也被称为试剂也被称为位点专一性抑制剂位点专一性抑制剂。1 1、亲和标记、亲和标记亲和标记修饰剂一般都是亲和标记修饰剂一

13、般都是底物底物、别别构效应物构效应物和和配体配体（如辅酶等）的（如辅酶等）的结结构上的类似物构上的类似物，因此这类修饰试剂，因此这类修饰试剂对蛋白质的活性部位具有高度的亲对蛋白质的活性部位具有高度的亲和性。和性。设计亲和标记要满足两个条件设计亲和标记要满足两个条件:（1 1）亲和试剂应当对活性部位）亲和试剂应当对活性部位专一性地专一性地结合结合。（2 2）亲和试剂必须含有能与某些氨基酸）亲和试剂必须含有能与某些氨基酸残基残基起反应起反应的的化学基团化学基团。在适宜的条件。在适宜的条件下，反应只能在活性部位上及其附近的下，反应只能在活性部位上及其附近的氨基酸残基上进行。氨基酸残基上进行。亲和标记

14、又称为专一性的不可逆抑制作用。亲和标记又称为专一性的不可逆抑制作用。可用于亲和标记的抑制剂有：可用于亲和标记的抑制剂有：Ks型的不可逆抑制剂型的不可逆抑制剂 Kcat型的不可逆抑制剂型的不可逆抑制剂（1 1）KsKs型的不可逆抑制剂型的不可逆抑制剂 这类具有和底物结构相似的结合基团，因此它这类具有和底物结构相似的结合基团，因此它可以与活性部位发生特异性结合，同时还具有一个可以与活性部位发生特异性结合，同时还具有一个活泼的反应基团，能和活性部位氨基酸残基的侧链活泼的反应基团，能和活性部位氨基酸残基的侧链基团进行修饰反应。基团进行修饰反应。反应包括两步：反应包括两步：试剂首先与活性部位发生特异性结

15、合；试剂首先与活性部位发生特异性结合；然后试剂中的活性基团与活性部位中的侧链基团发然后试剂中的活性基团与活性部位中的侧链基团发生化学反应，将标记基团共价连接于活性部位上。生化学反应，将标记基团共价连接于活性部位上。修饰有两个明显的特点：修饰有两个明显的特点：（1 1）底物、竞争性抑制剂或配体对修饰有保护作用；）底物、竞争性抑制剂或配体对修饰有保护作用；（2 2）修饰反应是定量定点的修饰。）修饰反应是定量定点的修饰。（2 2）KcatKcat型的不可逆抑制剂型的不可逆抑制剂 是根据酶催化过程设计的，这类抑制剂具是根据酶催化过程设计的，这类抑制剂具有有和底物类似的结构和底物类似的结构，具，具有被酶

16、结合和催化的有被酶结合和催化的性质性质，此外，还有一个，此外，还有一个潜伏反应基团潜伏反应基团，在酶对，在酶对它进行催化反应时，这个潜伏的反应基团被酶它进行催化反应时，这个潜伏的反应基团被酶催化而活化，对活性部位起不可逆抑制作用。催化而活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这类抑制剂的专一性很高，常被人们称为这类抑制剂的专一性很高，常被人们称为“自自杀性底物杀性底物”。1 1、光亲和标记、光亲和标记光亲和标记是亲和标记中极其光亲和标记是亲和标记中极其重要重要的一类。的一类。光亲和标记试剂，在结构上除了有一般亲光亲和标记试剂，在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个和试剂的特点外，还具有一个光

17、反应基团光反应基团。1 1、光亲和标记反应过程、光亲和标记反应过程第一步，试剂与蛋白质的活性部位在暗条第一步，试剂与蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性结合；件下发生特异性结合；第二步，光照，试剂被光激活后，产生第二步，光照，试剂被光激活后，产生1 1个个高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链基团发生反应。基团发生反应。2 2、光亲和标记的一般原理、光亲和标记的一般原理 光亲和标记试剂在光亲和标记试剂在暗条件暗条件下，只能与蛋下，只能与蛋白质的活性部位发生专一性的非共价结合，白质的活性部位发生专一性的非共价结合，形成形成1 1个复合物。只有在个复合物。只有在光

18、照光照的情况下，试剂的情况下，试剂被激活，产生被激活，产生1 1个非常活泼的反应官能基团，个非常活泼的反应官能基团，这个官能基团立即与附近活性部位的氨基酸这个官能基团立即与附近活性部位的氨基酸残基的侧链基团发生反应，形成一个共价的残基的侧链基团发生反应，形成一个共价的标记物。标记物。3 3、光亲和标记试剂具备的特点：、光亲和标记试剂具备的特点：（1 1）光亲和标记试剂在）光亲和标记试剂在黑暗黑暗中应是中应是化学惰性化学惰性物质，标记反应中所有的实验条件，如物质，标记反应中所有的实验条件，如T T、pHpH、试剂的氧化电位等都不能破坏光亲和修饰反应试剂的氧化电位等都不能破坏光亲和修饰反应的前体。

19、的前体。（2 2）标记试剂应）标记试剂应易于合成易于合成，放射性标记的光，放射性标记的光亲和试剂的合成尤为重要。亲和试剂的合成尤为重要。（3 3）光亲和标记试剂在反应后基本）光亲和标记试剂在反应后基本不引起不引起或或很少很少导致蛋白质的导致蛋白质的构象变化构象变化。（4 4）在某一光波下进行光亲和标记反应时，）在某一光波下进行光亲和标记反应时，不不应破坏其他生物分子体系应破坏其他生物分子体系如蛋白质、核酸。设如蛋白质、核酸。设计亲和标记方案时应考虑激活反应的光的波长计亲和标记方案时应考虑激活反应的光的波长不小于不小于300nm300nm。（5 5）光亲和标记的反应中间物应该是）光亲和标记的反应

20、中间物应该是高活性高活性。（6 6）高反应活性的中间物能够和受体蛋白质最）高反应活性的中间物能够和受体蛋白质最终形成终形成稳定的稳定的共价结合产物。共价结合产物。4 4、光亲和标记的优点：、光亲和标记的优点：（1 1）光亲和标记）光亲和标记试剂试剂在在暗条件下暗条件下呈呈化学惰性化学惰性物质。物质。（2 2）通过）通过光照光照很很容易控制容易控制其其标记的程度标记的程度、标标记速度记速度。（3 3）光反应产物的中间产物具有高活性，可）光反应产物的中间产物具有高活性，可以标记在一般情况下反应活性很低的疏水残基以标记在一般情况下反应活性很低的疏水残基和亲核氨基酸残基。也就是说，和亲核氨基酸残基。也

21、就是说，蛋白质的所有蛋白质的所有氨基酸残基极化都可以被标记氨基酸残基极化都可以被标记。第二节第二节 蛋白质的分子生物学改造蛋白质的分子生物学改造 蛋白质主链结构的化学修饰蛋白质主链结构的化学修饰 基因突变和基因融合基因突变和基因融合 定点诱变分为三类：定点诱变分为三类：（1 1）通过寡聚核苷酸介导的基因诱变；）通过寡聚核苷酸介导的基因诱变；（2 2）盒式诱变或片段取代诱变；）盒式诱变或片段取代诱变；（3 3）利用聚合酶链式反应，以双链）利用聚合酶链式反应，以双链DNADNA为为模板进行的基因诱变。模板进行的基因诱变。一、基因突变一、基因突变定点诱变定点诱变1 1、通过寡聚核苷酸介导的基因诱变、

22、通过寡聚核苷酸介导的基因诱变 通过添加、删除、置换通过添加、删除、置换DNADNA序列上的核苷酸，序列上的核苷酸，特异地产生个别氨基酸的突变特异地产生个别氨基酸的突变步骤如下：步骤如下：（1 1）将待突变的目的）将待突变的目的DNADNA片段克隆于片段克隆于M13M13噬菌体载体。噬菌体载体。（2 2）从重组）从重组M13M13噬菌体中制备单链噬菌体中制备单链DNADNA。（3 3）合成含有预定突变的寡核苷酸诱变引物，其中间）合成含有预定突变的寡核苷酸诱变引物，其中间部位是预定的突变序列，两端是互补区（与目的基因部位是预定的突变序列，两端是互补区（与目的基因诱变部位两侧的序列正确配对）。诱变部

23、位两侧的序列正确配对）。（4 4）诱变寡核苷酸与靶）诱变寡核苷酸与靶DNADNA杂交并利用杂交并利用DNADNA聚合酶进行聚合酶进行延伸，生成异源双链延伸，生成异源双链M13DNAM13DNA。（5 5）双链）双链M13DNAM13DNA的富集，可用超离心、凝胶电泳等手的富集，可用超离心、凝胶电泳等手段。将上述反应混合物中的双链段。将上述反应混合物中的双链M13DNAM13DNA部分纯化、富集。部分纯化、富集。（6 6）含突变基因的）含突变基因的M13M13噬菌体的筛选。将合成的双链噬菌体的筛选。将合成的双链DNADNA转化为大肠杆菌转化为大肠杆菌F+F+菌株。用上述诱变引物做成标记菌株。用上

24、述诱变引物做成标记探针，对转化产生的噬菌斑在不同温度下杂交，选出表探针，对转化产生的噬菌斑在不同温度下杂交，选出表现阳性的噬菌斑克隆，它们可能含有所要求的诱变基因。现阳性的噬菌斑克隆，它们可能含有所要求的诱变基因。（7 7）突变基因的鉴定。从选出的噬菌斑中制备）突变基因的鉴定。从选出的噬菌斑中制备DNADNA，用，用SangerSanger方法测定突变部位序列，与预定序列相符合的就方法测定突变部位序列，与预定序列相符合的就是所需的突变基因。是所需的突变基因。2 2、盒式诱变、盒式诱变 合成两套分别与靶合成两套分别与靶DNADNA的两条链互补的寡核苷酸的两条链互补的寡核苷酸（1025bp1025

25、bp）。其中一套由单一的一种与野生型靶）。其中一套由单一的一种与野生型靶DNADNA一条链的序列精确互补的寡聚核苷酸组成，另一套由一条链的序列精确互补的寡聚核苷酸组成，另一套由一系列互补于另一条链同一位置带有目标突变的简并一系列互补于另一条链同一位置带有目标突变的简并的寡聚核苷酸组成。这样，在有利于形成错配杂交的的寡聚核苷酸组成。这样，在有利于形成错配杂交的条件下将两条互补的寡聚核苷酸混合，则生成条件下将两条互补的寡聚核苷酸混合，则生成1 1个短的个短的双链双链DNADNA片段，可在片段的两端设计合适的突变末端，片段，可在片段的两端设计合适的突变末端，直接插入到重组质粒中以置换同源的野生型序列

26、。直接插入到重组质粒中以置换同源的野生型序列。如果在重组质粒中目的序列两端无合适的限制性内如果在重组质粒中目的序列两端无合适的限制性内切酶位点，可用定点诱变的方法引入，要求引入的切酶位点，可用定点诱变的方法引入，要求引入的酶切位点对载体质粒是单一的，而且对目的基因编酶切位点对载体质粒是单一的，而且对目的基因编码没有影响。这样，含有目的突变的一系列盒式双码没有影响。这样，含有目的突变的一系列盒式双链片段可以按需要在目的基因上任意置换，引入需链片段可以按需要在目的基因上任意置换，引入需要的突变。要的突变。3 3、PCRPCR 如果已获得蛋白质分子的如果已获得蛋白质分子的cDNAcDNA基因，可设计

27、基因，可设计1 1对引对引物，通过物，通过PCRPCR扩增出非全长扩增出非全长cDNAcDNA基因，缺失的序列由基因，缺失的序列由引物与模板引物与模板DNADNA的配对位置决定。如果在两条引物上的配对位置决定。如果在两条引物上分别引入基因上并不存在的限制性内切酶位点，可以分别引入基因上并不存在的限制性内切酶位点，可以方便地将缺失的基因克隆到合适的表达载体上。合成方便地将缺失的基因克隆到合适的表达载体上。合成若干套这样的引物，通过若干套这样的引物，通过PCRPCR扩增并克隆于表达载体，扩增并克隆于表达载体，可获得若干套缺失突变体。也可以在引物上设计转录可获得若干套缺失突变体。也可以在引物上设计转

28、录及翻译调控序列，利用体外转录及翻译调控序列，利用体外转录翻译系统表达相翻译系统表达相应的蛋白质。应的蛋白质。二、基因融合二、基因融合 融合蛋白经合适的表达系统表达后，即可融合蛋白经合适的表达系统表达后，即可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型 多功能蛋白。构建融合蛋白的基本原则是：第多功能蛋白。构建融合蛋白的基本原则是：第一个蛋白质基因的终止密码子删除，再接上带一个蛋白质基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白质或多肽基因，即有终止密码子的第二个蛋白质或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达。可实现两个基因的融合表达。三、三、tRNAt

29、RNA介导定点搀入非天然氨基酸介导定点搀入非天然氨基酸 基本过程：基本过程：（1 1）首先将目标蛋白质的基因重组入可用于体外转录）首先将目标蛋白质的基因重组入可用于体外转录的载体中；的载体中；（2 2）利用寡核苷酸介导的位点特异性突变，将为特定）利用寡核苷酸介导的位点特异性突变，将为特定氨基酸编码的密码子（如图氨基酸编码的密码子（如图AGCAGC）突变成无义密码）突变成无义密码（TAGTAG）；）；（3 3）利用）利用run offrun off转录或化学转录或化学/酶法反密码子环取代法酶法反密码子环取代法合成相应的校正合成相应的校正tRNAtRNA，并用，并用T4RNAT4RNA连接酶通过连

30、接酶通过PdCpAPdCpA-非非天然氨基酸，将非天然氨基酸连到校正天然氨基酸，将非天然氨基酸连到校正tRNAtRNA上。上。码子，将非天然氨基酸搀入到蛋白质分子的特定位点。码子，将非天然氨基酸搀入到蛋白质分子的特定位点。（4 4）通过体外转录体系，产生在特定位点突变成）通过体外转录体系，产生在特定位点突变成UAGUAG的的mRNAmRNA（5 5）通过体外翻译体系，借助携带有非天然氨基）通过体外翻译体系，借助携带有非天然氨基酸的校正酸的校正tRNAtRNA上的反密码子，通读上的反密码子，通读mRNAmRNA上的上的UAGUAG无无义密码子，将非天然氨基酸搀入到蛋白质分子的义密码子，将非天然氨基酸搀入到蛋白质分子的特定位点。特定位点。