植物组织培养精选课件.ppt

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1、关于植物组织培养第一页，本课件共有107页一、实验室设置及仪器设备一、实验室设置及仪器设备u实实验验室室是是进进行行组组培培研研究究的的主主要要场场所所，应应能能满满足足清清洗洗、培培养养基基制制备备、储储藏藏、无无菌菌操操作作、培培养养、鉴定等多方面的工作。鉴定等多方面的工作。（一）实验室设置（一）实验室设置n组织培养实验室组织培养实验室设置设置的总体要求的总体要求：n便于隔离便于隔离n便于操作便于操作n便于灭菌便于灭菌n便于观察便于观察第二页，本课件共有107页基本实验室基本实验室辅助实验室辅助实验室实验室实验室组成组成准备室准备室缓冲室缓冲室无菌操作室无菌操作室培养室培养室细胞生物学实验

2、室细胞生物学实验室温室温室生化分析实验室生化分析实验室第三页，本课件共有107页1、基本实验室基本实验室实实验验台台搁搁架架培养架培养架培养架培养架培培养养架架培培养养架架药药品品及及仪仪器器柜柜无菌台无菌台无菌台无菌台搁搁架架拉拉窗窗冰箱冰箱搁搁架架水槽水槽电电炉炉门门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室准备室缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室基本实验室布局平面图基本实验室布局平面图第四页，本课件共有107页组织培养准备实验室组织培养准备实验室第五页，本课件共有107页缓冲室缓冲室第六页，本课件共有107页无菌室（一）无菌室（一）第七页，本课件共有107页无菌室（二）无菌室（二）第八页，

3、本课件共有107页培养室培养室第九页，本课件共有107页2、辅助实验室、辅助实验室（1）细细胞胞生生物物学学实实验验室室 其其功功能能是是对对培培养养材材料料进进行行细细胞胞学学鉴鉴定定和和研研究究。要要求求清清洁洁、明明亮亮、干干燥燥，使使各各种种光光学学仪仪器器不不受受潮潮湿湿和和灰灰尘尘污污染染。应应配配置置各各种种显显微微镜镜、照相系统等。照相系统等。（2 2）生生化化分分析析室室 在在以以培培养养细细胞胞产产物物为为主主要要目目的的的的实实验验室室，应应建建立立相相应应的的分分析析化化验验实实验验室室，以以便便对对培培养养物物的的有有效效成成分分随随时时进进行行取取样样检检查查。离离

4、心心机机、酶酶联联免免疫疫检测仪、天平、检测仪、天平、PCRPCR仪等。仪等。第十页，本课件共有107页为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。（3 3）温室）温室第十一页，本课件共有107页（二）（二）仪器与设备仪器与设备1 1、基本设备、基本设备 冰箱冰箱 电炉电炉 酸度计酸度计 纯水器纯水器 天平天平 培养基分装器培养基分装器 搅拌器等搅拌器等第十二页，本课件共有107页冰箱冰箱酸度计酸度计电炉电炉第十三页，本课件共有107页天天平平纯纯水水器器第十四页，本课件共有107页培养基分装器培养基分装器搅拌器搅拌器第十五页，本课件共有107页2、灭菌设备、灭菌设

5、备 蒸汽压力灭菌锅蒸汽压力灭菌锅 干热消毒柜干热消毒柜 过滤灭菌装置过滤灭菌装置 喷雾消毒器喷雾消毒器 紫外灯紫外灯第十六页，本课件共有107页蒸汽压力灭菌锅蒸汽压力灭菌锅第十七页，本课件共有107页干热消毒柜干热消毒柜第十八页，本课件共有107页无菌瓶顶过滤装置无菌瓶顶过滤装置喷雾消毒器喷雾消毒器（参考图）（参考图）（参考图）（参考图）第十九页，本课件共有107页3 3、无菌操作设备、无菌操作设备 超超净净工工作作台台第二十页，本课件共有107页无菌接种箱无菌接种箱第二十一页，本课件共有107页4 4、细胞培养设备、细胞培养设备 摇摇 床床第二十二页，本课件共有107页培养架培养架第二十三页

6、，本课件共有107页HZC-250恒恒温温振振荡荡培培养养箱箱 150C250D光光照照培培养养箱箱 第二十四页，本课件共有107页5 5、细胞学鉴定设备、细胞学鉴定设备倒置显微镜倒置显微镜光光学学显显微微镜镜第二十五页，本课件共有107页1 1、玻璃器皿、玻璃器皿（三三）培养器皿及实验用具培养器皿及实验用具培养皿培养皿三角瓶三角瓶培养瓶培养瓶第二十六页，本课件共有107页2 2、金属材质用具、金属材质用具镊子镊子解剖刀解剖刀接种针接种针第二十七页，本课件共有107页1 1、洗涤液的、洗涤液的配制配制二、实验基本操作技术二、实验基本操作技术（一）洗涤技术（一）洗涤技术第二十八页，本课件共有10

7、7页（1 1）玻璃器皿洗涤）玻璃器皿洗涤 A A、新购买的玻璃器皿、新购买的玻璃器皿 表面常附着有游离的碱表面常附着有游离的碱性物质，可先用性物质，可先用0.50.5的去污剂洗刷，再用自来的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在水洗净，然后浸泡在1 12 2盐酸溶液中过夜盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在离子水冲洗两次，在100100120120烘箱内烘干备烘箱内烘干备用。用。2 2、洗涤方法、洗涤方法第二十九页，本课件共有107页 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污先用自来水洗刷至无污物，再用合适

8、的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在剂（粉）洗刷，或浸泡在0.50.5的清洗剂中超声清洗的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干计量仪器不可烘干）。）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。擦洗），重新清洗。B B、使用过的玻璃器皿的清洗、使用过的玻璃器皿的清洗第三十页，本课件共有107页

9、新购置玻璃新购置玻璃器皿器皿1%稀稀HCl浸渍浸渍12h洗衣粉洗衣粉洗涤洗涤清水清水冲洗冲洗烘干烘干备用备用已用过的玻璃已用过的玻璃器皿器皿第三十一页，本课件共有107页（2 2）塑料器皿的清洗）塑料器皿的清洗新的塑料器皿打开即用新的塑料器皿打开即用已用过的已用过的塑料器皿塑料器皿2%NaOH浸泡浸泡12h清水冲清水冲洗洗2%5%盐酸盐酸浸泡浸泡30min清水清水冲洗冲洗蒸馏水冲蒸馏水冲洗洗晾干备用晾干备用第三十二页，本课件共有107页 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，

10、一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。擦洗，然后火焰干燥。（3 3）金属用品洗涤）金属用品洗涤（4 4）除菌过滤器洗涤）除菌过滤器洗涤 用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。第三十三页，本课件共有107页（二）灭菌技术（二）灭菌技术1 1、灭菌的方法（具体参见第二章）、灭菌的方法（具体参见第二章）干热灭菌干热灭菌 玻璃器皿、金属器械玻璃器皿、金属器械 湿热灭菌湿热灭菌 培养基、蒸馏水、器械、棉塞等培养基、蒸馏水、器械、棉塞等熏蒸灭菌熏蒸灭菌 接种室、培养室接种室、培养室过滤灭菌过滤灭菌 液体培养基、蒸馏水

11、液体培养基、蒸馏水药剂灭菌药剂灭菌 培养材料培养材料烧灼灭菌烧灼灭菌 器械、瓶口、棉塞、包头纸器械、瓶口、棉塞、包头纸辐射灭菌辐射灭菌 接种室、培养间接种室、培养间第三十四页，本课件共有107页*外植体灭菌外植体灭菌流水冲洗流水冲洗1020min或或更长时间更长时间70%75%酒精酒精中浸泡中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞氯化汞液中浸泡液中浸泡10min左右左右蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗45次次在在10%的次氯酸钠、的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡饱和漂白粉浸泡30min左右左右备用备用第三十五页，本课件共有107页人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。人为因素（工作人员本身）：工作服、

12、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品因素器器皿皿和和用用具具培养皿培养皿玻璃器皿玻璃器皿 接种用具接种用具培养基：湿热培养基：湿热培培养养材材料料外部细菌：用水冲洗外部细菌：用水冲洗化学药剂处理化学药剂处理内部细菌内部细菌茎尖培养茎尖培养加抗生素：青霉素、利福平加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板、操作的空气：洗刷地板、95%酒精擦超净工作台酒精擦超净工作台用化学试剂薰蒸用化学试剂薰蒸污染来源污染来源（三）无菌操作技术（三）无菌操作技术第三十六页，本课件共有107页1 1、实验器具和材料的准备、实验器具和材料的准备2 2、用、用75%75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工的酒精擦拭超

13、净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌作台用紫外灯杀菌20min-30min20min-30min。注意：台面上的用。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。3 3、关紫外灯、打开风机，过、关紫外灯、打开风机，过5-10min5-10min进入缓冲间，以进入缓冲间，以75%75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）第三十七页，本课件共有107页4 4、用、用70707575的酒精拭擦台面并消毒

14、双手。试验的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。时间太长。第三十八页，本课件共有107页5 5、取流水冲洗（至少、取流水冲洗（至少30min30min）过的外植体，用一定的）过的外植体，用一定的消毒剂浸

15、泡消毒，用无菌水冲洗消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3434次，放入无菌培次，放入无菌培养皿中，养皿中，置于酒精灯火焰下方置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。行分离、切割或其他处理。第三十九页，本课件共有107页6 6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。烧瓶口，盖上瓶塞。7 7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。第四十页，本课件共有107页接种时在近火焰处打开瓶口，

16、使瓶倾斜，以免空气中接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中。微生物落入瓶中。正正 确确 错错 误误第四十一页，本课件共有107页整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速。整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速。正正 确确 错错 误误第四十二页，本课件共有107页接种过程中尽可能达到悬空要求接种过程中尽可能达到悬空要求正正 确确 错错 误误第四十三页，本课件共有107页接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正正 确确 错错 误误第四十四页，本课件共有107页瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正正 确确 错错

17、误误第四十五页，本课件共有107页接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生第四十六页，本课件共有107页接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中态学上端露于空气中正正 确确 错错 误误第四十七页，本课件共有107页用于外植体分离的母体植物材料一般有用于外植体分离的母体植物材料一般有3 3种来源：一是种来源：一是生长在自然环境下的植物生长在自然环境下的植物；二是；二是在温室控制环境条件在温室控制环境条件下生长的植物下生长的植物；三是；三是无菌环境下已经过离体培养的无菌环境下已经过离体培养的植物植物。

18、（四）外植体的选择与处理技术（四）外植体的选择与处理技术第四十八页，本课件共有107页（1 1）选择优良的基因型）选择优良的基因型 试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料，并且品地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。值的植物。（2 2）取材取材 从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。从生长旺盛、

19、健壮、无病虫害的植株上取材。母株代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容母株代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。易成功。1 1、外植体的选择、外植体的选择第四十九页，本课件共有107页（3 3）外植体大小选择）外植体大小选择 因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，茎尖大因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。（以后具体讲）重要。（以后具体讲）（4 4）选择外植体的时期）选择外植体的时期 外植体的生长动态往往与该物种的生长规律外植体的生长动态往往与该物种的生长规律（生物钟）有关。因此，最

20、好在植物生长的最适宜（生物钟）有关。因此，最好在植物生长的最适宜时期取材培养，会得到较好的结果。时期取材培养，会得到较好的结果。第五十页，本课件共有107页（1 1）外）外植体休眠的处理植体休眠的处理 有些植物的种子、幼胚、或芽，存在休眠。为了打破有些植物的种子、幼胚、或芽，存在休眠。为了打破休眠，可利用低温处理，或赤霉素等化学物质处理。因植休眠，可利用低温处理，或赤霉素等化学物质处理。因植物不同处理温度和时间有所不同。物不同处理温度和时间有所不同。（2 2）组织内生菌的处理）组织内生菌的处理 A.A.加入抗生素，注意抗生素的用量，高浓度容易造成加入抗生素，注意抗生素的用量，高浓度容易造成培养

21、物的死亡。培养物的死亡。B.B.取生长期旺盛的生长点部位作为起始培养的外植体。取生长期旺盛的生长点部位作为起始培养的外植体。C.C.取被内生菌污染的培养物的茎尖不停的转接。取被内生菌污染的培养物的茎尖不停的转接。2 2、外植体的处理、外植体的处理第五十一页，本课件共有107页三、培养基的成分及其配制三、培养基的成分及其配制（一）培养基的成分及其作用（一）培养基的成分及其作用1 1、无机营养物质、无机营养物质n培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了要连续的供给某些无机化学物质，除了C C、H H、O O之外，需要量比较多

22、的元素叫大量元素，需要量之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量营养元素。比较少的元素叫微量营养元素。第五十二页，本课件共有107页培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,SN,P,K,Ca,Mg,S。培养基中加入量最多的是培养基中加入量最多的是N N，N N一般以一般以硝酸盐或氨盐硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供。或者两者结合的盐提供。大量元素大量元素第五十三页，本课件共有107页l微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物

23、所需的微量元素有需的微量元素有FeFe、CuCu、ZnZn、B B、MoMo、MnMn、CoCo，ClCl。其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑多会引起生长抑制等毒害现象制等毒害现象。微量元素微量元素第五十四页，本课件共有107页2 2、有机化合物、有机化合物（1 1）维生素类物质）维生素类物质n维生素类物质在酶系统中有催化功能。维生素类物质在酶系统中有催化功能。n硫硫胺胺素素（VBVB1 1）与与愈愈伤伤组组织织的的产产生生和和生生活活力力有有关关，可可能能是是所所有有植植物

24、物组组织织培培养养初初期期需需要要的的维维生生素素；而而盐盐酸酸吡吡哆哆醇醇（VBVB6 6）促促进进根根的的生生长长，烟烟酸酸（VBVB3 3，又又称称维维生生素素PPPP）促促进进胚胚的的发发育育。有有的的配配方方中中还还使使用用了了泛泛酸酸钙钙（VBVB5 5）、生生物物素素（VHVH）、钴钴胺胺素素（VBVB1212），VCVC等。等。第五十五页，本课件共有107页（2 2）AAAA类物质类物质绝大多数绝大多数AAAA适量时对培养效果都有正向效应。常用的有适量时对培养效果都有正向效应。常用的有GlyGly（甘氨酸）、（甘氨酸）、AsnAsn（天冬酰胺）、（天冬酰胺）、GlnGln（谷氨

25、酰胺）（谷氨酰胺）。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。酪蛋白。第五十六页，本课件共有107页（3 3）糖类）糖类糖在培养基中的作用：糖在培养基中的作用：1 1）为细胞提供合成新物质的碳骨架）为细胞提供合成新物质的碳骨架 2 2）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3 3）维持渗透压）维持渗透压蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。用的碳源。第五十七页，本课件共有107页（4 4）其它有机物质）其它有机物质 1 1）肌醇（环己六醇）肌醇（环己六醇

26、）肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成脂，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成 2 2）天然有机物天然有机物 一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。现出了良好的促进作用。第五十八页，本课件共有107页n植物激素植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育是在植物体内合成的，对植物生长发育有

27、显著调节作用的微量有机物，而有显著调节作用的微量有机物，而植物生长调节植物生长调节剂是外源的调节植物生长发育的物质。剂是外源的调节植物生长发育的物质。n无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有加入养物的生存与最低生理活动，只有加入植物植物生长调节物质生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。分化。3 3、植物生长调节物质、植物生长调节物质第五十九页，本课件共有107页（1 1）生长素类）生长素类 1 1）吲哚类吲哚类：IAAIAA（吲哚乙酸）、（吲哚乙酸）、IBAIBA（吲哚丁酸）（吲哚丁酸）

28、、IPAIPA（吲哚丙酸）（吲哚丙酸）2 2）萘酸类萘酸类：NAANAA（萘乙酸）（萘乙酸）3 3）苯氧羧酸类苯氧羧酸类：2,4-D2,4-D（2,4-2,4-二氯苯氧乙酸）、二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T2,4,5-T（2,4,5-2,4,5-三氯苯氧乙酸）、三氯苯氧乙酸）、2,4,5-T2,4,5-TP P（2,4,5-2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素强的生长素。第六十页，本课件共有107页 生长素的生理作用生长素的生理作用1 1、促进细胞生长和细胞分裂、促进细胞生长和细胞分裂

29、2 2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力3 3、形成愈伤组织，促进生根、形成愈伤组织，促进生根4 4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。第六十一页，本课件共有107页A A：NAA 0mg/LNAA 0mg/L，芽（少），根（无），芽（少），根（无）B B：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组（少量），芽（少），根（无），愈伤组（少量）C C：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽（少），根（

30、多），愈伤组织（一定量），芽（少），根（多），愈伤组织（一定量）A B C第六十二页，本课件共有107页（2 2）细胞分裂素）细胞分裂素n是一类腺嘌呤衍生物。主要有是一类腺嘌呤衍生物。主要有6-6-苄基氨基嘌呤（苄基氨基嘌呤（6-6-BABA）、玉米素（）、玉米素（ZTZT）等。其中最常用的是）等。其中最常用的是6 6-苄基氨苄基氨基嘌呤。基嘌呤。n功能：功能：n促进细胞的分裂和分化促进细胞的分裂和分化n诱导芽的分化诱导芽的分化n促进侧芽的萌发和生长促进侧芽的萌发和生长n抑制衰老抑制衰老第六十三页，本课件共有107页A BA A：BA(0mg/L)BA(0mg/L)，芽（减少），根（增多）愈伤

31、组织（一定量），芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B B：BA(0.1mg/L)BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量），芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）第六十四页，本课件共有107页控制植物细胞分化控制植物细胞分化n分裂素分裂素/生长素生长素的比例是控制芽和根形成的比例是控制芽和根形成的一个重要条件的一个重要条件n比例高时比例高时产生芽产生芽,比例低时比例低时产生产生根根第六十五页，本课件共有107页生理作用：生理作用：1 1、诱导、诱导茎的细胞伸长茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效。型特别有效，对根无效。2

32、 2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同协同作用。作用。IAA/GAIAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。低有利于韧皮部的分化。3 3、破除破除种子、鳞茎、块茎种子、鳞茎、块茎休眠休眠，使之提前萌发。，使之提前萌发。4 4、对生长素和细胞分裂素的活性有、对生长素和细胞分裂素的活性有增效增效作用。作用。注：不耐热，应采用过滤灭菌加入。注：不耐热，应采用过滤灭菌加入。（3 3）赤霉素（）赤霉素（GA3GA3）第六十六页，本课件共有107页生理作用：生理作用：1 1、抑制蛋白质的合成、抑制蛋白

33、质的合成2 2、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GAGA的作用的作用3 3、诱导休眠、促进衰老和脱落、诱导休眠、促进衰老和脱落 （4 4）脱落酸（）脱落酸（ABAABA）第六十七页，本课件共有107页n 以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，还有害，实际工作中要具体分析。还有害，实际工作中要具体分析。生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般用用ppmppm表示表示 1ppm=

34、1mg/L 1ppm=1mg/L第六十八页，本课件共有107页(1 1)固化剂固化剂 琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些作琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些作物的花药培养）物的花药培养）琼脂的用量一般在琼脂的用量一般在4-10g/L4-10g/L，所购回的琼脂要先试，所购回的琼脂要先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。(2)(2)悬浮剂悬浮剂 FicollFicoll（聚蔗糖）（聚蔗糖）4 4、固化剂和悬浮剂、固化剂和悬浮剂第六十九页，本课件

35、共有107页1 1、根据无机盐的浓度，培养基分为：、根据无机盐的浓度，培养基分为：（1 1）高无机盐含量培养基）高无机盐含量培养基 钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要主要有有MSMS、LSLS、BLBL、BMBM、ERER培养基培养基。（二）培养基的种类（二）培养基的种类第七十页，本课件共有107页（2 2）

36、高硝态氮培养基）高硝态氮培养基 硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的VB1VB1。主要适合于十字花科植物、单子叶植物的组织和花药主要适合于十字花科植物、单子叶植物的组织和花药培养。主要有培养。主要有B5B5、N6N6、SHSH培养基。培养基。第七十一页，本课件共有107页（3 3）中等无机盐含量培养基）中等无机盐含量培养基 大量元素约为大量元素约为MSMS培养基的一半，微量元素种类减少，培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较但含量较MSMS的高，维生素种类比的高，维生素种类比MSMS多，如增加了生物素、多，如增加了生物素、叶酸等。叶酸等。适合于花药

37、培养适合于花药培养，主要有，主要有NitchNitch，NTNT、H H、MillerMiller培养基。培养基。第七十二页，本课件共有107页（4 4）低无机盐含量培养基）低无机盐含量培养基 大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于相对也很低。多数用于生根培养基生根培养基，主要有，主要有WhiteWhite、HellerHeller、WSWS、HEHE、HBHB培养基。培养基。第七十三页，本课件共有107页（1 1）初代培养基）初代培养基 用来第一次接种外植体的培养基。用来第一次接种外植体的培养基。（2 2）继代培养基）继代

38、培养基 用来接种继初代培养物的培养基。用来接种继初代培养物的培养基。2 2、根据培养物的培养过程，培养基分为：、根据培养物的培养过程，培养基分为：第七十四页，本课件共有107页3 3、根据其作用不同，培养基分为：、根据其作用不同，培养基分为：（1 1）诱导培养基）诱导培养基（2 2）增殖培养基）增殖培养基（3 3）生根培养基）生根培养基第七十五页，本课件共有107页4 4、根据其营养水平不同，培养基可分为：、根据其营养水平不同，培养基可分为：（1 1）基本培养基）基本培养基（就是通常称呼的培养基）（就是通常称呼的培养基）主要有主要有MSMS、WhiteWhite、N6N6、B5 B5、改良、改

39、良MSMS、HellerHeller、NitshNitsh、SHSH、MillerMiller等。等。（2 2）完全完全培养基培养基 就是基本培养基的基础上，根据试验的不就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。他复杂有机物质等。第七十六页，本课件共有107页1 1、无机营养成分无机营养成分：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：的经验，例如：MSMS是广谱性培养基，是广谱性培养基，N6N6用于单子叶植物的培养。用于单子叶植物的培养。豆科多用豆科

40、多用B5B5培养基。培养基。2 2、植物生长调节剂植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总体原则：必须进行筛选试验。总体原则-当诱导当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。3 3、有机成分：有机成分：要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。（三）培养基的筛选（三）培养基的筛选第七十七页

41、，本课件共有107页n 贮备液（母液）的配制贮备液（母液）的配制 为什么要配制母液？为什么要配制母液？1 1）方便）方便 2 2）准确（有些成分量太小）准确（有些成分量太小）（四）培养基的配制（四）培养基的配制第七十八页，本课件共有107页1 1、大量元素母液的配制、大量元素母液的配制各成分按照表各成分按照表1 1培养基浓度含量扩大培养基浓度含量扩大1010倍，按顺序逐步混合。后用蒸倍，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到馏水定容到1000m1000mL L的容量瓶中，即为的容量瓶中，即为1010倍的大量元素母液。倒入倍的大量元素母液。倒入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。细口瓶，贴好标签保存于冰箱中

42、。配制培养基时，每配配制培养基时，每配1L1L培养基取此液培养基取此液100m100mL L。第七十九页，本课件共有107页注意：注意：(1)(1)某些无机成分如某些无机成分如CaCa2+2+、SOSO4 42 2-、MgMg2 2+和和H H2 2POPO4 4-等在一起可能发等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。先以

43、少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将特别应将CaCa2+2+、SOSO4 42 2-、MgMg2 2+和和H H2 2POPO4 4-等离子错开混合，速度宜慢，边等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。搅拌边混合。(2)CaCl(2)CaCl2 22H2H2 2O O要在要在最后单独加入最后单独加入，在溶解，在溶解CaClCaCl2 22H2H2 2O O时，蒸馏时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的水需加热沸腾，除去水中的COCO2 2，以防沉淀。另外，以防沉淀。另外，CaClCaCl2 22H2H2 2O O放入放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。沸水中易沸腾，操

44、作时要防止其溢出。第八十页，本课件共有107页、微量元素母液的配制、微量元素母液的配制MSMS培养基的微量元素无机盐由培养基的微量元素无机盐由7 7种化合物（除种化合物（除FeFe）组成。）组成。微量元素用量较少，特别微量元素用量较少，特别是是CuSOCuSO4 45H5H2 2O O、CoClCoCl2 26H6H2 2OO，因此在配制中分，因此在配制中分微量微量、配制。按照表配制。按照表2 2，表，表3 3配方，用感量为配方，用感量为0.0001g0.0001g的分析天平称量，其它同大量元素。配制培的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，养基时，每配制每配制1L1L培养基，取微量培养

45、基，取微量10m10mL L，微量，微量m mL L。第八十一页，本课件共有107页第八十二页，本课件共有107页3 3、铁盐母液的配制、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁柠檬酸铁，只需和大，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养配制方法同上，直

46、接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，基时，配制配制1L1L取此液取此液10m10mL L。第八十三页，本课件共有107页在在配配制制铁铁盐盐时时，如如果果加加热热搅搅拌拌时时间间过过短短，会会造造成成FeSFeSO O4 4和和NaNa2 2EDTAEDTA鳌鳌合合不不彻彻底底，此此时时若若将将其其冷冷藏藏，FeSFeSO O4 4会会结结晶晶析析出出。为为避避免免此此现现象象发发生生，配配制制铁铁盐盐母母液液时时，FeSFeSO O4 4和和NaNa2 2EDTAEDTA应应分分别别加加热热溶溶解解后后混混合合，并并置置于于加加热热搅搅拌拌器器上上不不断断搅搅拌拌至至溶溶液液呈呈金金黄黄色

47、色(约加热约加热20-30 min)20-30 min)，调，调pHpH值至值至5 5.5 5，室温放置冷却后，再冷藏。，室温放置冷却后，再冷藏。第八十四页，本课件共有107页4 4、有机母液的配制、有机母液的配制MSMS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。并贮存在棕色无菌瓶中。电子分析天平。并贮存在棕色无菌瓶中。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然

48、后定容。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。第八十五页，本课件共有107页一般植物生长调节剂母液配制的终浓度以一般植物生长调节剂母液配制的终浓度以0.5mg/m0.5mg/mL L为好，需要注为好，需要注意的是：意的是：（）配制生长素类（）配制生长素类 例如例如IAAIAA（吲哚乙酸）、（吲哚乙酸）、NAANAA（萘乙酸）、（萘乙酸）、2 2,4-D4-D、IBAIBA（吲哚丁酸），应先用少量（吲哚丁酸），应先用少量95%95%乙醇或无水乙醇充分乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用溶解，或者用1mol/L1mol/L的的NaOHNaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。溶解，然后用蒸馏水定容

49、到一定的浓度。以后者效果好。以后者效果好。（）细胞分裂素（）细胞分裂素 应先用少量应先用少量95%95%乙醇或无水乙醇加乙醇或无水乙醇加3 3-4 4滴滴1mol/L1mol/L的盐酸溶解，或直接用的盐酸溶解，或直接用1mol/L HCl1mol/L HCl溶解，再用蒸馏水定容。溶解，再用蒸馏水定容。（）（）GA3GA3(赤霉素赤霉素)以以95%95%酒精溶解（不耐高温，过滤灭菌）酒精溶解（不耐高温，过滤灭菌）保存在棕色试剂瓶中。保存在棕色试剂瓶中。5 5、植物生长调节剂母液配制、植物生长调节剂母液配制第八十六页，本课件共有107页注意：注意：所有母液都要贴上标签，所有母液都要贴上标签，注明名

50、称、配制倍注明名称、配制倍数、日期数、日期，所有的母液都应保存在，所有的母液都应保存在0 0-44冰箱中，冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。第八十七页，本课件共有107页在培养基的配制过程中，常需要用氢氧化钾或氢氧化钠在培养基的配制过程中，常需要用氢氧化钾或氢氧化钠和盐酸来调整培养基的酸碱度：和盐酸来调整培养基的酸碱度：（1 1）1 1摩尔摩尔/升升KOHKOH液的配制液的配制:称取称取57.157.1克克KOH,KOH,加蒸馏水加蒸馏水至至10001000毫升毫升.2 2）1 1摩尔摩尔/升升NaOHNaOH液的配制液的配制:称取称取4040克克