蛋白质的通性纯化和表征精选课件.ppt

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1、关于蛋白质的通性纯化和表征第一页，本课件共有58页 第一节第一节 蛋白质的性质蛋白质的性质一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质蛋白质中的功能团蛋白质中的功能团 末端末端NH2NH2 末端末端COOHCOOH 侧链基团侧链基团所以，在某种意义上，所以，在某种意义上，蛋白质的化学物理性质蛋白质的化学物理性质AAAA的化学物理性质的化学物理性质第二页，本课件共有58页A A 蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用 B B 蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团，此蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团，此外，还有少数的末端外，还有少数的末端-COOH,-

2、NH-COOH,-NH2 2 ，若是缀合蛋白质，则在辅基成分中还可能包含可以解离的基团若是缀合蛋白质，则在辅基成分中还可能包含可以解离的基团 C C蛋白质分子中可解离基团的蛋白质分子中可解离基团的pKpK和游离和游离AAAA中相应基团的中相应基团的pKpK值是完全不相同值是完全不相同 D D 蛋白质可看作一个多价离子蛋白质可看作一个多价离子带电性质和数量决定于带电性质和数量决定于可解离基团的种类、数量可解离基团的种类、数量溶液的溶液的pH第三页，本课件共有58页蛋白质等电点蛋白质等电点对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白质来说，在某一pHpH值，蛋值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电

3、荷为零。这一白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pHpH称为蛋白质等电点称为蛋白质等电点第四页，本课件共有58页n短肽的等电点和净电荷量可以根据短肽的等电点和净电荷量可以根据pKpK值计算，蛋白质的等电值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。点要用等电聚焦等方法测定。n等电聚焦电泳：等电聚焦电泳：这是一种特殊的电泳，其载体上铺有连续的PH梯度的缓冲液，然后将蛋白质点样，只要该处的PH与蛋白质的PI不同，则蛋白质就会带电，PH值PI时，蛋白质带-电；PH值PI时，蛋白质带+电。通电后，蛋白质就会移动，直到某处的PHPI，蛋白质才呈电中性，不再移动，因此，可以测出PI。第五页，

4、本课件共有58页l蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，会使有规则化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，会使有规则的螺旋、球状等空间结构变为无规则的伸展肽链，从的螺旋、球状等空间结构变为无规则的伸展肽链，从而引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。而引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。二、变性与复性二、变性与复性第六页，本课件共有58页1、变性的实质：、变性的实质：次级键的断裂，所以一级结构完好次级键的断裂，所以一级结构完

5、好2、变性蛋白质的特点：、变性蛋白质的特点：生物活性丧失生物活性丧失侧链基团暴露，水溶性降低侧链基团暴露，水溶性降低易被蛋白酶水解（这就是熟食易于消化的道理）易被蛋白酶水解（这就是熟食易于消化的道理）3 3、变性因素：、变性因素：物理因素：加热、高压、紫外线等物理因素：加热、高压、紫外线等化学因素：有机溶剂、脲、胍、强酸、强碱化学因素：有机溶剂、脲、胍、强酸、强碱第七页，本课件共有58页l变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都

6、伴随着不可逆沉淀。白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。第八页，本课件共有58页3、复性：、复性：renaturation有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，某些蛋白质缓慢有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，某些蛋白质缓慢重新回复到天然构像。重新回复到天然构像。例如，核糖核酸酶在例如，核糖核酸酶在-巯基乙醇和巯基乙醇和8M尿素作用下发生尿素作用下发生的变性，经过透析去除尿素和的变性，经过透析去除尿素和-巯基乙醇，酶蛋白又可恢巯基乙醇，酶蛋白又可恢复其原来的构象，生物学活性也几乎全部恢复。复其原来的构象，生物学活性也几乎全部恢复。许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性许多蛋白质变性时被破坏严重，

7、不能恢复，称为不可逆性变性。变性。第九页，本课件共有58页三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀（一）、（一）、蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一种分散系统，在这种分散系统中，蛋白质是分蛋白质溶液是一种分散系统，在这种分散系统中，蛋白质是分散相，蛋白质散相，蛋白质分子量很大，一般在分子量很大，一般在10000-100000010000-1000000之间，在水之间，在水溶液中分子直径在溶液中分子直径在1-100nm1-100nm之间，之间，因此，因此，蛋白质溶液是一种蛋白质溶液是一种胶体溶液系统，从而具有胶体溶液胶体溶液系统，从而具有胶体溶液的性质，如不

8、能通过半透膜、电泳现象等。因此可用透析和的性质，如不能通过半透膜、电泳现象等。因此可用透析和电泳的方法来分离、纯化蛋白质电泳的方法来分离、纯化蛋白质。溶液分散系统根据分散程度可分为溶液分散系统根据分散程度可分为3类：类：真溶液真溶液分散相质点小于分散相质点小于1nm 悬浊液悬浊液分散相质点大于分散相质点大于100nm 胶体溶液胶体溶液分散相质点介于分散相质点介于1-100nm 第十页，本课件共有58页（1）蛋白质的分子大小在）蛋白质的分子大小在1 100nm之间，属于胶体质之间，属于胶体质点的范围，在动力学上是稳定的；点的范围，在动力学上是稳定的；（2）水化层：蛋白质表面多亲水基团）水化层：蛋

9、白质表面多亲水基团(-COOH、-OH、-SH、-CONH2 等）等），具有强烈地吸引水分子作用，在水溶液，具有强烈地吸引水分子作用，在水溶液中蛋白质颗粒的表面形成一层很厚的水化膜，从而阻止中蛋白质颗粒的表面形成一层很厚的水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集；蛋白质颗粒的相互聚集；（3）同性电荷：在非等电点时蛋白颗粒带有相同的净电荷，）同性电荷：在非等电点时蛋白颗粒带有相同的净电荷，相互排斥，与其周围的反离子构成稳定的双电层。相互排斥，与其周围的反离子构成稳定的双电层。维持蛋白质胶体稳定性的因素：维持蛋白质胶体稳定性的因素：第十一页，本课件共有58页 破坏蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会凝聚成大

10、的破坏蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会凝聚成大的质点而从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。质点而从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。(precipitation)(precipitation)。（二）、蛋白质的沉淀反应（二）、蛋白质的沉淀反应第十二页，本课件共有58页1、盐析法、盐析法 沉淀蛋白质的方法沉淀蛋白质的方法 盐析盐析(salting out)加盐使蛋白质沉淀析出的现象；加盐使蛋白质沉淀析出的现象；原因：加入高浓度的中性盐（如原因：加入高浓度的中性盐（如H4N2SO4、Na2SO3、NaCl等），可有效破坏蛋白质颗粒的水化层，同时又中和等），可有效破坏蛋白质颗粒的水化层，同时又中和了蛋白质

11、的电荷，使蛋白质产生沉淀；了蛋白质的电荷，使蛋白质产生沉淀；盐析法是最常用的分离蛋白质的方法；盐析法是最常用的分离蛋白质的方法；盐析一般不引起蛋白质的变性，当除去盐后又可以盐析一般不引起蛋白质的变性，当除去盐后又可以溶解。溶解。第十三页，本课件共有58页 用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来。盐硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白

12、至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。质沉淀的效果更好。应用应用：血清中的球蛋白的提血清中的球蛋白的提取取第十四页，本课件共有58页 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。调节蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加加调节蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加加速蛋白质沉淀。速蛋白质沉淀。常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。在低常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。在低温条件下，则变性进行较缓慢

13、，可用于分离制备蛋温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备蛋白质白质。2、有机溶剂沉淀蛋白质、有机溶剂沉淀蛋白质 第十五页，本课件共有58页 当溶液当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）结合成不溶）结合成不溶性盐而沉淀。性盐而沉淀。重金属沉淀的蛋白质通常是变性的，误食重金属盐后可重金属沉淀的蛋白质通常是变性的，误食重金属盐后可大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。金属盐呕吐出来解毒。若在低温条件

14、下，并控制重金属离子浓度，也可用于分若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。离制备不变性的蛋白质。3、重金属盐沉淀蛋白质、重金属盐沉淀蛋白质 第十六页，本课件共有58页 pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂电（酸根阴离子）的生物碱试剂(如苦味酸、钨如苦味酸、钨酸、鞣酸酸、鞣酸)以及某些酸以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)生成不溶性盐而沉淀。生成不溶性盐而沉淀。血液化学分析时常利用此原理除去血液中的血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中

15、蛋白质。蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。4、生物碱试剂和某些酸类沉淀蛋白质、生物碱试剂和某些酸类沉淀蛋白质 第十七页，本课件共有58页 将接近于等电点的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生将接近于等电点的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。凝固而沉淀。加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。都凝固。5、加热凝固、加热凝固 第十

16、八页，本课件共有58页第二节第二节 蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征第十九页，本课件共有58页一、分离提纯的一般程序：一、分离提纯的一般程序：蛋白质提纯的总目标蛋白质提纯的总目标-增加制品纯度或比活性、几增加单位蛋增加制品纯度或比活性、几增加单位蛋白质垂悬中所要蛋白质的含量或生物活血清中的球蛋白。白质垂悬中所要蛋白质的含量或生物活血清中的球蛋白。分离提纯蛋白质的一般程序：分离提纯蛋白质的一般程序：前处理前处理粗分离粗分离细分离细分离重结晶重结晶第二十页，本课件共有58页（1 1）前处理）前处理细菌细菌动物组织动物组织植物组织植物组织超声波超声波+砂研磨、砂研磨、高压挤压高压挤压

17、或溶菌酶或溶菌酶破碎破碎石英砂石英砂+提取提取液或纤维素液或纤维素酶酶破碎破碎电动捣碎机、电动捣碎机、匀浆器、超匀浆器、超声波声波破碎破碎提取介质提取介质得到所要的蛋白质得到所要的蛋白质对于细胞核染色体、核对于细胞核染色体、核糖体中的蛋白质糖体中的蛋白质分开分开差速离心差速离心第二十一页，本课件共有58页2).粗级分离粗级分离(常用沉淀法常用沉淀法)主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。常用以下方法：缩。常用以下方法：沉淀法沉淀法 除盐除盐 浓缩浓缩第二十二页，本课件共有58页（1）、硫酸铵分级盐析）、硫酸铵分级盐析硫酸

18、铵硫酸铵盐分子水化，夺走了蛋白盐分子水化，夺走了蛋白质表面的水化层，蛋白质质表面的水化层，蛋白质聚集沉淀。聚集沉淀。第二十三页，本课件共有58页（3 3）重金属盐沉淀）重金属盐沉淀（4 4）、生物碱试剂与）、生物碱试剂与某些酸沉淀某些酸沉淀 （2 2）、）、pI pI 沉淀沉淀第二十四页，本课件共有58页 利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和盐分开。盐分开。浓缩浓缩用冻干、超滤等方法浓缩用冻干、超滤等方法浓缩除盐除盐透析透析第二十五页，本课件共有58页3)3)、细分离、细分离 以上方法得到的制剂可供工业应用。如需高纯样品，以上方法得到的制

19、剂可供工业应用。如需高纯样品，应精制应精制 4)4)、结晶：蛋白质分离纯化的最后步骤、结晶：蛋白质分离纯化的最后步骤 本身伴随着一定程度的提纯本身伴随着一定程度的提纯 重结晶：可除去少量夹杂的蛋白质重结晶：可除去少量夹杂的蛋白质 蛋白质纯度愈高、溶液愈浓就愈容易结晶蛋白质纯度愈高、溶液愈浓就愈容易结晶 样品进一步提纯的方法：凝胶过滤、离子交换层析、样品进一步提纯的方法：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、电泳等。吸附层析、亲和层析、电泳等。第二十六页，本课件共有58页二、二、蛋白质分离纯化方法蛋白质分离纯化方法（1）分子大小、（）分子大小、（2）溶解度、（）溶解度、（3）电荷、（）电荷

20、、（4）吸）吸附性质、（附性质、（5）对其他分子的生物学亲和力）对其他分子的生物学亲和力第二十七页，本课件共有58页（一）、根据分子大小不同的纯化方法（一）、根据分子大小不同的纯化方法1、透析和超过滤、透析和超过滤透析透析超过滤超过滤滤滤膜膜压力过滤压力过滤离心力过滤离心力过滤第二十八页，本课件共有58页 在在层层析析柱柱中中装装入入葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶颗颗粒粒。这这种种凝凝胶胶颗颗粒粒具具有有多多孔孔的的网网状状结结构构。这这些些网网孔孔只只允允许许较较小小的的分分子子进进入入颗颗粒粒内内，而而大大于于网网孔孔的的分分子子则则被被排排阻阻。当当用用洗洗脱脱液液洗洗脱脱时时，被被排排阻阻的的相

21、相对对分分子子质质量量大大的的分分子子先先被被洗洗脱脱下下来来，相相对对分分子子质质量量小的分子后下来。小的分子后下来。2、凝胶过滤、凝胶过滤（1）、凝胶过滤的介质）、凝胶过滤的介质第二十九页，本课件共有58页 （2）、凝胶过滤的原理）、凝胶过滤的原理第三十页，本课件共有58页（二）利用溶解度差别的分离方法（二）利用溶解度差别的分离方法影响蛋白质溶解度的主要因素：影响蛋白质溶解度的主要因素：溶液的溶液的pH离子强度离子强度介电常数介电常数温度温度第三十一页，本课件共有58页 蛋白质处于蛋白质处于PI时，净电荷为零，相邻分子之间没有静电时，净电荷为零，相邻分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀斥力而

22、趋于聚集沉淀1 等电点沉淀和等电点沉淀和PH控制控制不同蛋白质不同蛋白质 等电点不同等电点不同 PI时溶解度最低时溶解度最低将蛋白质彼此分开将蛋白质彼此分开第三十二页，本课件共有58页2蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析 中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响：盐溶盐溶低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度在等电点时，中性盐在等电点时，中性盐K2SO4对一氧化碳血红蛋白的影响对一氧化碳血红蛋白的影响第三十三页，本课件共有58页作用机理：作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子彼蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋

23、白质分子彼此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。第三十四页，本课件共有58页原理大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶原理大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。水化层。盐析当离子强度增加到足够高时，如饱和或半饱和程度，盐析当离子强度增加到足够高时，如饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀出来，这种现象叫盐析。很多蛋白质从水溶

24、液中沉淀出来，这种现象叫盐析。盐析法分离、提纯常用方法。保持蛋白质的天然构象。盐析法分离、提纯常用方法。保持蛋白质的天然构象。（NH4)2SO4第三十五页，本课件共有58页血清半饱和硫酸铵离心球蛋白沉淀血清离心饱和硫酸铵白蛋白沉淀研究得最多的蛋白质之一研究得最多的蛋白质之一鸡蛋清的卵清蛋白就是用盐析鸡蛋清的卵清蛋白就是用盐析法得到的：法得到的：第三十六页，本课件共有58页3有机溶解分级法有机溶解分级法如果：如果：那么变性问题在很大程度上可以得到解决那么变性问题在很大程度上可以得到解决第三十七页，本课件共有58页作用原理：作用原理：.有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个有机溶剂的加入改

25、变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离相反电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。.有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。并沉淀。第三十八页，本课件共有58页4温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响 在在40-50 C以上，大部分蛋白质变得不稳定以上，大部分蛋白质变得不稳定,开始变性，开始变性，一般在中性一般在中性pH介质中失去溶解力。介质中失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较

26、稳定大多数蛋白质在低温下比较稳定,因此蛋白质的操作因此蛋白质的操作一般在一般在0 C或更低温度下进行。或更低温度下进行。在在0-40C之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增大。而增大。第三十九页，本课件共有58页(三三)根据电荷不同的分离纯化方法根据电荷不同的分离纯化方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。合物的方法有电泳和离子交换层析两类。1、电泳、电泳第四十页，本课件共有58页第四十一页，本课件共有58页1)、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(P

27、AGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。质的电泳方法。丙烯酰胺单丙烯酰胺单体体聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺链链N，N，N，N一四甲基一四甲基乙二胺乙二胺过硫酸铵过硫酸铵交叉联接而交叉联接而形成凝胶形成凝胶N，N一亚甲一亚甲 双丙双丙烯酰胺烯酰胺调节单体的不调节单体的不同浓度同浓度不同程度交链不同程度交链结构结构第四十二页，本课件共有58页因此，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率因此，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。那么如

28、果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率是那么如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率是不是就取决于分子的大不是就取决于分子的大 小，就可以用电泳技术测定蛋白质小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。的分子量。连续的连续的整个电泳系统中所用缓冲液，整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔值和凝胶网孔都是相同的都是相同的不连续的不连续的电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液，电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。缩成层，从而提高分辨能力。在聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为：

29、在聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为：第四十三页，本课件共有58页 1967年，年，Shapiro等发现阴离子去污剂：十二烷基硫酸等发现阴离子去污剂：十二烷基硫酸钠（钠（SDS）具有这种作用，当向蛋白质溶液中加入足够）具有这种作用，当向蛋白质溶液中加入足够量量SDS和巯基乙醇，和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白因而掩盖了不同种

30、蛋白质间原有的电荷差别。这样的蛋白质质间原有的电荷差别。这样的蛋白质SDS复合物，复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。第四十四页，本课件共有58页2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）是一种阴离子）是一种阴离子去污剂，于去污剂，于100加热，在加热，在-巯基乙醇存在下，可以使大

31、多数多巯基乙醇存在下，可以使大多数多聚体蛋白质的四级结构解体，并与各亚基牢固地结合，从而聚体蛋白质的四级结构解体，并与各亚基牢固地结合，从而遮蔽了蛋白质分子上原有电荷，同时带上强的负电荷。遮蔽了蛋白质分子上原有电荷，同时带上强的负电荷。第四十五页，本课件共有58页 由于所有的由于所有的SDS-蛋白质复合物，在电泳时都以同样的电荷蛋白质复合物，在电泳时都以同样的电荷按分子量大小不同向正极移动，作按分子量大小不同向正极移动，作SDS聚丙烯酰胺凝胶泳聚丙烯酰胺凝胶泳动（动（SDS-PAGE）时，）时，其泳动速度仅决定于蛋白质的分子其泳动速度仅决定于蛋白质的分子量量。SDS与蛋白质的结合是成比例的，所

32、以与蛋白质的结合是成比例的，所以SDS-蛋白质蛋白质复合物在泳动中的不同速率，就反映了分子量的不同。与复合物在泳动中的不同速率，就反映了分子量的不同。与分子量的对数和相对迁移率成一定比例关系。使用已知分分子量的对数和相对迁移率成一定比例关系。使用已知分子量的标准物作标准曲线或用计算法确定标准曲线的常数，子量的标准物作标准曲线或用计算法确定标准曲线的常数，即可求出未知样品的分子量。用这种方法测定的分子量是即可求出未知样品的分子量。用这种方法测定的分子量是亚单位肽链的分子量。亚单位肽链的分子量。第四十六页，本课件共有58页分子量及静电荷密度分子量及静电荷密度均影响泳动率均影响泳动率只有分子量影只有

33、分子量影响泳动率响泳动率第四十七页，本课件共有58页 毛细管电泳技术是一种基于毛细管电泳技术是一种基于“不同组分在溶液中电不同组分在溶液中电泳迁移速度不同泳迁移速度不同”的原理，利用电解槽和与之相连的毛的原理，利用电解槽和与之相连的毛细管对样品组成进行分离和检测的化学分析技术。细管对样品组成进行分离和检测的化学分析技术。3、毛细管电泳毛细管电泳第四十八页，本课件共有58页4、等电聚焦等电聚焦 在外电场作用下，各种蛋白质将移向并聚焦在等在外电场作用下，各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的于其等电点的pH梯度处。梯度处。第四十九页，本课件共有58页当样品当样品中的蛋白中的蛋白质质泳泳动动至相等至

34、相等于于其其 pI 的的 pH 位置位置时时，其，其净电净电荷荷会变为零会变为零(pH=pI)，因而因而聚焦于该处聚焦于该处不不动动。因。因此此等电聚焦等电聚焦是依是依据据分子分子 pI 的不同的不同来来作分作分离。离。pH梯度制作一般利用两性电解质梯度制作一般利用两性电解质Ampholyte，两性电，两性电解质解质是一是一种种混合物，含有各混合物，含有各种连续种连续 pI 的小分子。的小分子。若在聚丙烯若在聚丙烯酰酰胺胺凝胶凝胶內加入內加入 ampholyte，通通电后电后 ampholyte 会会在在凝胶凝胶中中形成一形成一 pH 梯度梯度。第五十页，本课件共有58页（四）利用对配体的特异

35、生物学亲和力的纯化方法（四）利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法亲和层亲和层析析 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体之间，均具有专一的亲设计的层析技术。如抗原和抗体之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。第五十一页，本课件共有58页把可结合的一对分子的一方把可结合的一对分子的一方(称配体称配体)结合在惰性载体上使其结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该

36、载体，双方即结合为一整固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。力的某一特定的物质。具体操作：具体操作：第五十二页，本课件共有58页具备下述特性：具备下述特性：高度亲水，高度亲水，惰性载体，惰性载体，具有相当量的化学基团可供活化，在温和条件下能与较大量配体具有相当量的化学基团可供活化，在温和条件下能与较大量配体连接；连接；有较好的物理化学稳定性不易受周围条件有较好的物理化学稳定性不易受周围条件(加加PH、离子强度、离子强度、温度、变性剂和去污剂等温度、变性剂和去污剂等

37、)的影响，的影响，具有多孔的网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过而增加具有多孔的网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过而增加配体的有效浓度；配体的有效浓度；有良好的机械性能，利于控制层析速度，最好是均一的珠有良好的机械性能，利于控制层析速度，最好是均一的珠状颗粒。状颗粒。（1）载体的选择）载体的选择第五十三页，本课件共有58页（2）常用的配体）常用的配体抗体纯化中常用的配体是抗原，此外，抗体纯化中常用抗体纯化中常用的配体是抗原，此外，抗体纯化中常用的配体还有蛋白的配体还有蛋白A和蛋白和蛋白G。第五十四页，本课件共有58页（一）名词解释（一）名词解释超二级结构超二级结构(super-sec

38、ondary structure）；）；结构域（结构域（structural domain,domain）；）；蛋白质的三级结构（蛋白质的三级结构（tertiary stracture of protein）；）；蛋白质的变性作用蛋白质的变性作用(denaturation of protein)；练习题：练习题：第五十五页，本课件共有58页（二）填充题n1、蛋白质分子中氮的平均含量为_，故样品中的蛋白质含量常以所测氮量乘以_即是。n2、除半胱氨酸和胱氨酸外，含硫的氨基酸还有_，除苏氨酸和酪氨酸外，含羟基的氨基酸还有_，在蛋白质中常见的20种氨基酸中，_是一种亚氨基酸，_不含不对称碳原子。n3、

39、蛋白质的氨基酸残基是由_键连接成链状结构的，其氨基酸残基的_称蛋白质的一级结构。n4、-折叠片结构的维持主要依靠两条肽键之间的肽键形成_来维持。n5、在螺旋中C=O和NH之间形成的氢键与_基本平行，每圈螺旋包含_个氨基酸残基，高度为_，每个氨基酸残基使螺旋轴上升_，并沿轴旋转_度。第五十六页，本课件共有58页n6、用凝胶过滤法分离蛋白质，相对分子质量较小的蛋白质在柱中滞留的时间较_，因此最先流出凝胶柱的蛋白质，其相对分子质量最_。n7、稳定蛋白质胶体溶液的因素是_和_。n8、免疫球蛋白G（IgG）含有_条重链，_条轻链，通过_键联接成Y形结构，每一分子含有_个抗原结合部位。n9、一般说来，球状蛋白质在其分子内部含有_性氨基酸残基，而在分子外表面含_性氨基酸残基。n10、胰蛋白酶专一性地切断_和_的羧基端肽键。第五十七页，本课件共有58页感谢大家观看第五十八页，本课件共有58页