酶工程动植物细胞培养产酶精选课件.ppt

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1、EnzymeEnzymeEngineeringEngineering关于酶工程动植物细关于酶工程动植物细胞培养产酶胞培养产酶第一页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶概述动物细胞动物细胞无细胞壁，容易贴壁无细胞壁，容易贴壁对营养要求严格（血清培养基）对营养要求严格（血清培养基）对环境敏感（对环境敏感（pH、溶氧、温度、剪切应力）、溶氧、温度、剪切应力）植物细胞植物细胞有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱营养要求较动物细胞简单营养要求较动物细胞简单生长缓慢，培养周期长

2、，要达到高密度较困难生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难第二页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶概述植物细胞、动物细胞、微生物细胞培养的比较植物细胞、动物细胞、微生物细胞培养的比较特征特征特征特征哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞植物细胞植物细胞植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞微生物细胞微生物细胞大小大小大小大小 (m)m)101010010010101001001 11010生长形式生长形式生长形式生长形式悬浮、贴壁悬浮、贴壁悬浮、贴壁悬浮、贴壁悬浮悬浮悬浮悬浮悬浮悬

3、浮悬浮悬浮营养要求营养要求营养要求营养要求很复杂很复杂很复杂很复杂很复杂很复杂很复杂很复杂简单简单简单简单倍增时间倍增时间倍增时间倍增时间 (h)(h)151510010020201201200.50.55 5细胞分化细胞分化细胞分化细胞分化有有有有有限分化有限分化有限分化有限分化无无无无环境影响环境影响环境影响环境影响非常敏感非常敏感非常敏感非常敏感敏感敏感敏感敏感一般一般一般一般产物存在部位产物存在部位产物存在部位产物存在部位胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外产物浓度产物浓度产物浓度产物浓度低低低低低低低

4、低高高高高供氧需求供氧需求供氧需求供氧需求 (K KL La a)1 125252020303010010010001000产物种类产物种类产物种类产物种类疫苗、单抗、酶、疫苗、单抗、酶、疫苗、单抗、酶、疫苗、单抗、酶、生长因子、激素等生长因子、激素等生长因子、激素等生长因子、激素等天然色素、天然天然色素、天然天然色素、天然天然色素、天然有机化合物等有机化合物等有机化合物等有机化合物等抗生素、有机抗生素、有机抗生素、有机抗生素、有机小分子、酶等小分子、酶等小分子、酶等小分子、酶等第三页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细

5、胞胞 培培 养养 产产 酶酶概述植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较动物细胞、植物细胞和微生物细胞可以用相同方式培养动物细胞、植物细胞和微生物细胞可以用相同方式培养动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长植物细胞和动物细胞对剪切力敏感植物细胞和动物细胞对剪切力敏感植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同动物细胞动物细胞 蛋白疫苗、抗体、激素、酶（蛋白质或多肽）蛋白疫苗、抗体、激素、酶（蛋白质或多肽）植物细胞植物细胞 色素、香精、天然药物（小分子）、酶色素、香精、天然药

6、物（小分子）、酶第四页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶本章主要内容动植物细胞中酶生物合成的调节动植物细胞中酶生物合成的调节植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞及其培养特点植物细胞及其培养特点植物细胞培养及产酶的工艺控制植物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞及其培养特点动物细胞及其培养特点动物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养及产酶的工艺控制第五页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动动动 植植植植 物物

7、物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动植物细胞中酶生物合成的调节从基因到蛋白质从基因到蛋白质有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植物细胞有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植物细胞动植物细胞具有比微生物更多的调节方式动植物细胞具有比微生物更多的调节方式转录水平调节转录水平调节翻译水平调节翻译水平调节 激素水平、神经水平调节激素水平、神经水平调节激素水平、神经水平调节激素水平、神经水平调节第六页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动植物细胞中酶生物

8、合成的调节细胞分化改变酶的生物合成细胞分化改变酶的生物合成 端粒（端粒（telomere）端粒是真核生物染色体的末端结构端粒是真核生物染色体的末端结构由富含由富含 G、T 的的 DNA 简单重复序列不断重复而成简单重复序列不断重复而成人端粒序列：人端粒序列：TTAGGG保护真核生物染色体免遭破坏保护真核生物染色体免遭破坏牺牲自我，填补牺牲自我，填补 DNA 复制后在复制后在 5-端留下的空隙端留下的空隙端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短端粒酶（端粒酶（telomerase）催化端粒合成和延长催化端粒合成和延长核糖核蛋白，其中的核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模

9、板序列，可构建端粒重部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重复序列复序列端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中第七页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动植物细胞中酶生物合成的调节基因扩增加速酶的合成基因扩增加速酶的合成通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶段通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过程或细胞分化某一过程细胞的一种应急方式细胞的一种应急方式基因扩增可以由基因扩增可以由 选择压力选择压力选择压力选择压力

10、 引起引起耐药性细胞的抗药性产生耐药性细胞的抗药性产生例：例：CHO 细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码这种酶的基细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增因急剧扩增第八页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动植物细胞中酶生物合成的调节增强子促进酶的生物合成增强子促进酶的生物合成增强子（增强子（modulator）能高效增强或促进基因转录的一段能高效增强或促进基因转录的一段DNA 序列序列增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些增强子能促

11、进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些酶基因的表达酶基因的表达具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同第九页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动植物细胞中酶生物合成的调节抗原诱导抗体酶的生物合成抗原诱导抗体酶的生物合成抗体酶（抗体酶（abzyme）：催化性抗体，是）：催化性抗体，是具有生物催化功能的抗体分子，是人具有生物催化功能的抗体分子，是人工改造的对抗体可变区赋予催化特性工改造的对抗体可变区赋予催化特性的特殊抗体的特

12、殊抗体修饰法修饰法在抗体与抗原结合部位引进催化基团在抗体与抗原结合部位引进催化基团诱导法（主要方法）诱导法（主要方法）半抗原诱导半抗原诱导酶蛋白诱导酶蛋白诱导第十页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶1902 年，年，Haberlandt 首次提出分离植物单细胞并培养成首次提出分离植物单细胞并培养成植株的设想植株的设想植物细胞的全能性植物细胞的全能性HaberlandtHaberlandt第十一页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineeri

13、ng动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶种类植物细胞培养产酶种类产酶植物细胞产酶植物细胞产酶植物细胞产酶植物细胞产酶品种产酶品种产酶品种产酶品种胡萝卜细胞胡萝卜细胞胡萝卜细胞胡萝卜细胞糖苷酶糖苷酶糖苷酶糖苷酶紫苜蓿细胞紫苜蓿细胞紫苜蓿细胞紫苜蓿细胞 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶甜菜细胞甜菜细胞甜菜细胞甜菜细胞过氧化物酶、酸性过氧化物酶、酸性过氧化物酶、酸性过氧化物酶、酸性/碱性转化酶、糖化酶碱性转化酶、糖化酶碱性转化酶、糖化酶碱性转化酶、糖化酶大豆细胞大豆细胞大豆细胞大豆细胞过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶过氧化

14、物酶、苯丙氨酸裂合酶过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶花生细胞花生细胞花生细胞花生细胞苯丙氨酸裂合酶苯丙氨酸裂合酶苯丙氨酸裂合酶苯丙氨酸裂合酶假挪威槭细胞假挪威槭细胞假挪威槭细胞假挪威槭细胞漆酶漆酶漆酶漆酶利马豆细胞利马豆细胞利马豆细胞利马豆细胞 -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶番木瓜细胞番木瓜细胞番木瓜细胞番木瓜细胞木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶大蒜细胞大蒜细胞大蒜细胞大蒜细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶菠萝细胞菠萝细胞菠萝细胞菠萝细胞菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶剑麻细胞剑麻细

15、胞剑麻细胞剑麻细胞剑麻蛋白酶剑麻蛋白酶剑麻蛋白酶剑麻蛋白酶第十二页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶植物细胞结构植物细胞结构第十三页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶植物细胞的主要特点植物细胞的主要特点体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长

16、生长周期长生长周期长生长周期长营养要求较动物细胞简单营养要求较动物细胞简单细胞生长及合成次级代谢产物需要细胞生长及合成次级代谢产物需要光照光照光照光照 条件条件 对剪切力较敏感对剪切力较敏感对剪切力较敏感对剪切力较敏感主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）第十四页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养的优势植物细胞培养的优势提高目标物的产率提高目标物的产率缩短生产周期缩短生产周期木瓜蛋白酶：木瓜生长期木

17、瓜蛋白酶：木瓜生长期 8 个月，木瓜细胞培养约个月，木瓜细胞培养约 1 个月个月易于管理，不受自然因素控制易于管理，不受自然因素控制可以提高产物质量可以提高产物质量通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染缺点缺点培养条件要求高培养条件要求高 光照、剪切力影响显著光照、剪切力影响显著植物细胞生长缓慢植物细胞生长缓慢 相对于微生物相对于微生物第十五页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物体外培养植

18、物体外培养胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养第十六页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 外植体选择和处理外植体选择和处理外植体（外植体（explant）从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小块块根、茎、叶、芽、花、果实、种子等根、茎、叶、芽、花、果实、种子等选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则切

19、片：切片：0.51 cm消毒消毒70%乙醇乙醇5%次氯酸钠次氯酸钠/10%漂白粉漂白粉0.010.1%HgCl2第十七页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 获取植物细胞：直接分离法获取植物细胞：直接分离法直接分离法即直接从外植体中分离直接分离法即直接从外植体中分离机械法机械法将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞质壁未分离；质壁未分离；细胞破碎率高细胞破碎率高细胞破碎率高细胞破碎率高，完整细胞数量少，完整细胞数量少酶解法酶解法

20、利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞能降解细胞壁，必须对细胞给予能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护渗透压保护渗透压保护渗透压保护第十八页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 获取植物细胞：愈伤组织诱导法获取植物细胞：愈伤组织诱导法 愈伤组织（愈伤组织（愈伤组织（愈伤组织（calluscallus）由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的由外

21、植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散排列疏散排列疏散排列疏散排列 的的薄壁细胞薄壁细胞薄壁细胞薄壁细胞群群体体本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的组织愈合的组织诱导过程诱导过程配制半固体诱导培养基配制半固体诱导培养基灭菌、植入外植体灭菌、植入外植体13周后继代培养周后继代培养第十九页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 获取植物细胞：原生质体再生法获取植物细

22、胞：原生质体再生法一般采用酶解法分离原生质体，使用一般采用酶解法分离原生质体，使用纤维素酶纤维素酶纤维素酶纤维素酶和和果胶酶果胶酶果胶酶果胶酶混合物混合物保持溶液的保持溶液的 高渗高渗高渗高渗 状态状态防止原生质体胀裂防止原生质体胀裂渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等原生质体培养，再生细胞壁原生质体培养，再生细胞壁第二十页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养植物细胞培养 悬浮培养悬浮培养将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密

23、度悬浮在液体培养基将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法中进行培养的方法悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜植物细胞培养植物细胞培养 产物分离纯化产物分离纯化收集培养液，从中获得所需的产物收集培养液，从中获得所需的产物第二十一页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶植物细胞培养基植物细胞培养基水：一般用去离子水或蒸馏水水：一般用去离子水或蒸馏水无机成分无机成分大量元素：大量元素：N、

24、P、K、Ca、Mg、S微量元素：微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co有机成分有机成分碳源：糖，以碳源：糖，以 蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖 最常用最常用氮源：氨基酸（氮源：氨基酸（Gly、Ala、Ser、Cys）及蛋白水解物、无机氮）及蛋白水解物、无机氮维生素：主要是维生素：主要是 B 族维生素和维生素族维生素和维生素 C 生长调节剂：生长激素、细胞分裂素等（微量）生长调节剂：生长激素、细胞分裂素等（微量）生长调节剂：生长激素、细胞分裂素等（微量）生长调节剂：生长激素、细胞分裂素等（微量）其他：肌醇、琼脂等其他：肌醇、琼脂等第二十二页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeri

25、ngEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶常用的植物细胞培养基常用的植物细胞培养基MS 培养基培养基硝酸盐浓度较高，营养成分适宜，使用范围广硝酸盐浓度较高，营养成分适宜，使用范围广B5 培养基培养基NH4+浓度较低，适用于双子叶木本植物浓度较低，适用于双子叶木本植物White 培养基培养基无机盐浓度低，高无机盐浓度低，高Mg(II)、B(III)，适用于生根培养，适用于生根培养KM-8P 培养基培养基有机成分种类齐全，用于原生质体培养有机成分种类齐全，用于原生质体培养培养基配制培养基配制配制母液，使用时按需要稀释配制母液，使用时按需要稀释第二

26、十三页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶工艺条件及其控制（掌握要点，与微生物对比）工艺条件及其控制（掌握要点，与微生物对比）温度温度室温范围（室温范围（25 oC左右）左右）最适产酶温度和最适生长温度不同最适产酶温度和最适生长温度不同pH微酸性（微酸性（pH 56）细胞培养时，细胞培养时，pH一般变化不大一般变化不大溶解氧溶解氧植物细胞植物细胞需氧量不高需氧量不高需氧量不高需氧量不高，供氧不宜过量，供氧不宜过量对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧

27、烈对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈第二十四页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶工艺条件及其控制工艺条件及其控制 光照光照光照光照光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植物特色）光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植物特色）光照有时也抑制产物合成光照有时也抑制产物合成添加前体添加前体前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质添加前体相对于添加了反应的底物添加前体相对于添加了反应的底物刺激剂（刺激剂（elector）引导物质朝特定的

28、代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成常用微生物细胞壁碎片和胞外酶常用微生物细胞壁碎片和胞外酶第二十五页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶植物细胞培养产酶产酶实例产酶实例 大蒜细胞培养产大蒜细胞培养产 SOD超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1）生物体内清除超氧化物阴离子自由基（生物体内清除超氧化物阴离子自由基（O2-）的重要金属酶

29、类）的重要金属酶类SOD 和过氧化氢酶和过氧化氢酶(catalase)、过氧化物酶、过氧化物酶(peroxidase，POD)一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应细胞正常的生理代谢和生化反应第二十六页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶产酶实例产酶实例 大蒜细胞培养产大蒜细胞培养产 SOD大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮选取

30、结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮先用先用 70%乙醇消毒乙醇消毒 20 s，再用，再用 0.1%升汞消毒升汞消毒 10 min，然后无菌水，然后无菌水漂洗漂洗 3 次次在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成 0.5 cm3 的小块，植入含有的小块，植入含有 3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的半固体的半固体 MS 培养基中培养基中25 oC，600 lux，12 h/d 光照条件下培养光照条件下培养 18 天，诱导得到愈伤组织，天，诱导得到愈伤组织，每每 18 天继代一次天继代一次第二十七页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngi

31、neering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶植物细胞培养产酶产酶实例产酶实例 大蒜细胞培养产大蒜细胞培养产 SOD大蒜细胞悬浮培养大蒜细胞悬浮培养将上述在半固体将上述在半固体 MS 培养基上培养培养基上培养 18 天的愈伤组织，在无菌条件天的愈伤组织，在无菌条件下转入含有下转入含有 3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的液体的液体 MS 培养基中，培养基中，加入灭菌的玻璃珠，加入灭菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/d 光照条件下振荡培养光照条件下振荡培养 1012 天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞天，使愈伤组织分散成为小细胞团

32、或单细胞无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有 3 mg/L 2,4-D 和和 1.2 mg/L 6-BA 的液体的液体 MS 培养基中，培养基中，25 oC，600 lux，12 h/d 光照条件下，振荡培养光照条件下，振荡培养 18 天天SOD 分离纯化分离纯化收集细胞，破碎，用收集细胞，破碎，用 pH 7.8 磷酸盐缓冲液提取磷酸盐缓冲液提取第二十八页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶1907年，年，Harrison

33、 开创了动物组织培养的先河开创了动物组织培养的先河从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝固的淋巴液中培从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝固的淋巴液中培养，蝌蚪的神经组织存活了数周，并且从神经细胞中长出了神经养，蝌蚪的神经组织存活了数周，并且从神经细胞中长出了神经纤维纤维1950s，Earle 用动物细胞培养制取病毒疫苗用动物细胞培养制取病毒疫苗1967年，动物细胞贴壁培养微载体开发年，动物细胞贴壁培养微载体开发1975年，杂交瘤技术年，杂交瘤技术动物细胞可产生较高价值的物质动物细胞可产生较高价值的物质激素、疫苗、单克隆抗体、酶激素、疫苗、单克隆抗体、酶第二十九页，本课件共有45页E

34、nzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶动物细胞结构动物细胞结构第三十页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶动物细胞特性动物细胞特性 没有细胞壁没有细胞壁没有细胞壁没有细胞壁，细胞脆弱（区别于植物和微生物），细胞脆弱（区别于植物和微生物）体积大体积大体积大体积大，比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞，比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞在肌体内相互在肌体内相互粘连粘连粘连粘连，以群

35、体形式存在，以群体形式存在在培养时具有群体效应、在培养时具有群体效应、贴壁依赖性贴壁依赖性贴壁依赖性贴壁依赖性、接触抑制性、功能全能性、接触抑制性、功能全能性营养要求复杂（营养要求复杂（血清血清血清血清 培养基）培养基）第三十一页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的特点动物细胞培养的特点主要用于生产蛋白质主要用于生产蛋白质生长缓慢生长缓慢容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素 对剪切力特别敏感对剪切力特

36、别敏感对剪切力特别敏感对剪切力特别敏感（胞外缺少保护结构）（胞外缺少保护结构）大部分具有贴壁依赖性大部分具有贴壁依赖性 贴壁培养贴壁培养贴壁培养贴壁培养培养基成分复杂，价格高昂培养基成分复杂，价格高昂细胞生命有限，一般最多继代培养细胞生命有限，一般最多继代培养 50 代即退化死亡代即退化死亡第三十二页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养方式动物细胞培养方式 悬浮培养悬浮培养适用于非贴壁依赖型细胞适用于非贴壁依赖型细胞 杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞、肿瘤细

37、胞、体液（血液、淋巴液）、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴液）细胞细胞类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别大差别对通气、搅拌耐受性差对通气、搅拌耐受性差对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比例例 COCO2 2优点（相对于贴壁培养）优点（相对于贴壁培养）细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好传代培养容易，无需消化分散细胞传代培养容易，无需消化分散细胞培养基中营养成分利用率高培养基中营养成分利用率高第三十三页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineerin

38、gEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养方式动物细胞培养方式 贴壁培养贴壁培养适用于贴壁依赖型细胞适用于贴壁依赖型细胞上皮细胞、成纤维细胞上皮细胞、成纤维细胞细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂滚瓶培养系统滚瓶培养系统结构简单，但结构简单，但比表面积小比表面积小比表面积小比表面积小微载体培养系统微载体培养系统由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球兼具单层培养和悬浮培养的优势兼具单层培养和悬浮培养的优势细胞生长环境均一细胞生长环境均一第三十四页，本

39、课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养方式动物细胞培养方式 固定化培养固定化培养贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用吸附法吸附法载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒 贴壁型细胞的微载体培养贴壁型细胞的微载体培养贴壁型细胞的微载体培养贴壁型细胞的微载体培养即属此类即属此类包埋法包埋法将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中细胞不易脱落细

40、胞不易脱落固定化培养优点固定化培养优点细胞损伤程度低，可重复使用细胞损伤程度低，可重复使用产物分离容易产物分离容易第三十五页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养过程动物细胞培养过程种质细胞种质细胞体细胞（动物体内组织取出）体细胞（动物体内组织取出）杂交瘤细胞杂交瘤细胞基本工艺过程基本工艺过程第三十六页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养基

41、动物细胞培养基氨基酸：必需氨基酸，如氨基酸：必需氨基酸，如 谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺 等，作为碳源和能源利用等，作为碳源和能源利用维生素：维生素：B 族和维族和维 C，可由，可由 血清血清血清血清 提供提供无机盐：调节无机盐：调节渗透压渗透压渗透压渗透压微量元素：微量元素：Fe、Cu、Zn 等，可由血清提供等，可由血清提供葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸）葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸）激素：胰岛素、生长激素、甾体激素等，可由血清提供激素：胰岛素、生长激素、甾体激素等，可由血清提供生长因子：如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等，一生长因子：如表皮生长因子、神经生长因

42、子、成纤维细胞生长因子等，一般来源于血清般来源于血清培养基配制培养基配制配制母液，使用前过滤除菌、稀释；配制母液，使用前过滤除菌、稀释；Gln Gln 单独配制，冷冻保存单独配制，冷冻保存单独配制，冷冻保存单独配制，冷冻保存第三十七页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制动物细胞培养的工艺条件及其控制温度温度影响细胞生长，哺乳动物细胞：影响细胞生长，哺乳动物细胞：36.50.25 oC影响影响 COCO2 2 溶解

43、度，从而影响培养液溶解度，从而影响培养液 pHpH 值值 渗透压渗透压渗透压渗透压保持细胞内外等渗状态，一般保持细胞内外等渗状态，一般 700850 kPa溶解氧溶解氧供氧不足：细胞生长受抑制供氧不足：细胞生长受抑制过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞用用混合气混合气混合气混合气代替空气（空气、代替空气（空气、O2、N2、COCO2 2）第三十八页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动动动 植植植植 物物物物 细细细细 胞胞胞胞 培培培培 养养养养 产产产产 酶酶酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的工

44、艺条件及其控制动物细胞培养的工艺条件及其控制pH 值与值与 CO2 浓度浓度动物细胞培养液动物细胞培养液 pH 在在 7.07.6 之间，以之间，以 pH 7.4pH 7.4 为最佳为最佳最常用的缓冲体系为最常用的缓冲体系为 COCO2 2/NaHCO/NaHCO3 3动物细胞培养时缺少动物细胞培养时缺少 CO2，培养液中的，培养液中的 HCO3-会被耗尽；会被耗尽；COCO2 2 保持保持保持保持了了了了 HCOHCO3 3-的浓度，以提供稳定的缓冲环境的浓度，以提供稳定的缓冲环境的浓度，以提供稳定的缓冲环境的浓度，以提供稳定的缓冲环境通常通常 CO2 浓度维持在浓度维持在 210%之间之间

45、指示剂：酚红指示剂：酚红第三十九页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制动物细胞培养的工艺条件及其控制pH 值值 HEPES 缓冲体系缓冲体系HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸羟乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonic acidHEPES is a zwitter-ionic organic chemical buffering agent.HEPES is widely used

46、in cell culture,largely because it is better at maintaining physiological pH despite changes in carbon dioxide concentration(produced by cellular respiration)when compared to bicarbonate buffers,which are also commonly used in cell culture.HEPES is like water in that its dissociation decreases as th

47、e temperature decreases.This makes HEPES a more effective buffering agent for maintaining enzymestructure and function at low temperatures.第四十页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动物细胞培养产酶相关问题相关问题 为什么培养的细胞要及时传代为什么培养的细胞要及时传代传代培养：将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继续扩大传代培养：将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继续扩大培养的阶段培养的阶

48、段体外培养的细胞大多具有体外培养的细胞大多具有生长接触抑制生长接触抑制生长接触抑制生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长其他细胞包围的时候，它就会停止生长当细胞铺满培养器皿表面时，正常细胞停止生长，但是转化（即发当细胞铺满培养器皿表面时，正常细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的、对接触抑制不敏感的细胞会继续生长生遗传物质突变）的、对接触抑制不敏感的细胞会继续生长如果不及时传代，这些如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞转化的细胞就会逐步取代正常的细胞转化的细胞就会逐步取代正常的细胞转化的细胞就会逐步取代正常

49、的细胞，导致，导致正常细胞的退化正常细胞的退化动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶?第四十一页，本课件共有45页EnzymeEnzymeEngineeringEngineering动动 植植 物物 细细 胞胞 培培 养养 产产 酶酶动物细胞培养产酶产酶实例产酶实例 人黑色素瘤细胞培养生产人黑色素瘤细胞培养生产 tPATissue plasminogen activator(abbr.tPA)is a protein involved in the breakdown of blood clots.It is a serine protease(EC 3.4.21.68)foun

50、d on endothelial cells,the cells that line the blood vessels.As an enzyme,it catalyzes the conversion of plasminogen to plasmin,the major enzyme responsible for clot breakdown.Because it works on the clotting system,tPA is used in clinical medicine to treat only embolic or thrombotic stroke.Use is c