实验三 光合作用的希尔反应.ppt

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1、实验三 光合作用的希尔反应 植物生物学实验植物生物学实验-植物生理部分植物生理部分n n离离体体叶叶绿绿体体加加到到具具有有适适当当氢氢受受体体（A A）溶溶液液中中，光光照照后后放放出出氧气。氧气。2H2H2 2O+2A 2AHO+2A 2AH2 2+O+O2 2 实实验验中中用用的的氧氧化化剂剂A A是是2,62,6二二氯氯靛靛酚酚（2,62,6-D D），是是一一种种蓝蓝色色染染料料，接接受受电电子子和和H H+后后被被还还原原成成无无色色。在在光光下下，叶叶绿绿体体将将2,62,6-D D还还原原，从从蓝蓝色色到到无无色色。通通过过测测定定其其光光密密度度的的变变化化，可以得出叶绿体的

2、还原能力。可以得出叶绿体的还原能力。光叶绿体【实验原理实验原理】Cl2OHClClNHOHClNOHO 2H2O2 O2光光叶绿体叶绿体氧化型二氯靛氛氧化型二氯靛氛（蓝色）（蓝色）还原型二氯靛氛还原型二氯靛氛（无色）（无色）DCMU(DCMU(二氯苯基二甲基脲，二氯苯基二甲基脲，二氯苯基二甲基脲，二氯苯基二甲基脲，dichlorophenyldichlorophenyl dimethyluresdimethylures,商品名为敌草隆，商品名为敌草隆，商品名为敌草隆，商品名为敌草隆，diurondiuron)等除草剂是作用等除草剂是作用等除草剂是作用等除草剂是作用于光合作用光系统于光合作用光系

3、统于光合作用光系统于光合作用光系统IIII中质体醌中质体醌中质体醌中质体醌QQB B结合部位结合部位结合部位结合部位 。它们竞争。它们竞争。它们竞争。它们竞争性地替换与性地替换与性地替换与性地替换与DIDI蛋白结合着的质体醌蛋白结合着的质体醌蛋白结合着的质体醌蛋白结合着的质体醌QQB B，导致电子传递导致电子传递导致电子传递导致电子传递受阻，抑制受阻，抑制受阻，抑制受阻，抑制HillHill反应的发生。反应的发生。反应的发生。反应的发生。非环式光合磷酸化与假环式光合磷酸化均可被非环式光合磷酸化与假环式光合磷酸化均可被非环式光合磷酸化与假环式光合磷酸化均可被非环式光合磷酸化与假环式光合磷酸化均可

4、被DCMUDCMU所所所所抑制，而环式光合磷酸化则不被抑制，而环式光合磷酸化则不被抑制，而环式光合磷酸化则不被抑制，而环式光合磷酸化则不被DCMUDCMU抑制。抑制。抑制。抑制。n n菠菜叶片菠菜叶片【实验材料】n n实验器材：实验器材：研钵研钵研钵研钵;移液管移液管移液管移液管;离心机离心机离心机离心机;722722型分光光型分光光型分光光型分光光度汁度汁度汁度汁;500500瓦灯泡瓦灯泡瓦灯泡瓦灯泡n n实验试剂：实验试剂：(1)(1)提取液提取液提取液提取液(0.02M(0.02M Tris-HClTris-HCl 缓冲液，含有缓冲液，含有缓冲液，含有缓冲液，含有0.4M0.4M蔗糖，蔗

5、糖，蔗糖，蔗糖，0.03M 0.03M KClKCl，pH7.5)pH7.5)；(2)(2)DCMuDCMu(用用用用0.02M 0.02M TrisTris-HCI-HCI缓缓缓缓冲液配制成冲液配制成冲液配制成冲液配制成5M DCMU5M DCMU溶液溶液溶液溶液)；(3)2,6-D,(3)2,6-D,即即即即2,6-2,6-二氯靛酚二氯靛酚二氯靛酚二氯靛酚(用用用用0.02M 0.02M TrisTris-HCI-HCI缓冲液配制成缓冲液配制成缓冲液配制成缓冲液配制成0.0030.003 2,6-D2,6-D溶液溶液溶液溶液)；(4)80(4)80丙丙丙丙酮；酮；酮；酮；(5)0.4M(5

6、)0.4M蔗糖等蔗糖等蔗糖等蔗糖等【实验器材与试剂】n n叶绿体的提取叶绿体的提取叶绿体的提取叶绿体的提取 将将4g4g新新鲜鲜叶叶片片去去叶叶脉脉后后剪剪碎碎，放放于于预预冷冷的的研研钵钵，加加入入4mL4mL预预冷冷的的提提取取液液，研研磨磨成成匀匀浆浆，再再加加4mL4mL预预冷冷的的提提取取液液混混匀匀，将将所所有有的的匀匀浆浆液液用用4 4层层纱布过滤，弃去杂质。纱布过滤，弃去杂质。收收集集过过滤滤液液于于离离心心管管中中，41000rpm41000rpm离离心心 3min3min，收收集集上上清清液液于于一一新新的的离心管，弃去沉淀。离心管，弃去沉淀。4 4 3000rpm3000

7、rpm离离心心5min5min，弃弃去去上上清清液液，将将沉沉沉沉淀淀淀淀悬悬悬悬浮浮浮浮于于于于冷冷冷冷的的的的4mL4mL提提提提取取取取液液液液，即为叶绿体提取液。即为叶绿体提取液。n n叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定 取取0.1ml0.1ml叶叶叶叶绿绿绿绿体体体体悬悬悬悬浮浮浮浮液液液液于于7ml7ml离离心心管管，用用4.9ml 4.9ml 8080丙丙丙丙酮酮酮酮稀稀释释到到5ml5ml，混混匀后，在匀后，在652nm652nm下测定吸光度，来计算叶绿素含量。下测定吸光度，来计算叶绿素含量。C(mg/mLC(mg/mL)=OD)=OD652652

8、1/34.51/34.5稀释倍数稀释倍数 用用预预先先冷冷冻冻的的提提提提取取取取液液液液稀稀稀稀释释释释叶叶绿绿体体悬悬浮浮液液，总总总总体体体体积积积积8mL8mL，使使叶叶绿绿体体悬悬浮浮液浓度约相当于叶绿素浓度为液浓度约相当于叶绿素浓度为0.04mg/mL0.04mg/mL。【实验步骤实验步骤】n nHillHill反应反应反应反应 取取9 9支试管，包好黑纸并编号支试管，包好黑纸并编号1-91-9，按下表所列试剂分别加入，按下表所列试剂分别加入9 9支试管中。支试管中。提取缓冲液做参比，提取缓冲液做参比，提取缓冲液做参比，提取缓冲液做参比，600nm600nm读取读取1 1号管光密度

9、，分别取号管光密度，分别取0.5mL0.5mL和和1mL1mL叶绿体悬浮液放入叶绿体悬浮液放入2 2号和号和3 3号试管中，立即于号试管中，立即于600nm600nm读取光密度，再按表中要求加入叶绿体悬浮液于其它试管中，然后读取光密度，再按表中要求加入叶绿体悬浮液于其它试管中，然后把黑纸剥掉把黑纸剥掉,将将4 4号、号、6 6号和号和8 8号管放在距光源号管放在距光源20cm20cm处，把处，把5 5号、号、7 7号和号和9 9号管放在距光源号管放在距光源60cm60cm处（处（注意：试管放在盛有水的烧杯中注意：试管放在盛有水的烧杯中注意：试管放在盛有水的烧杯中注意：试管放在盛有水的烧杯中），

10、），1010分钟后，立即用黑纸把试管包好放冰浴中，分钟后，立即用黑纸把试管包好放冰浴中，然后于然后于600nm600nm分别读取光密度。分别读取光密度。试试试试管号管号管号管号提取液提取液提取液提取液/mLmL叶叶叶叶绿绿绿绿体体体体/mLmLDCMu/mLDCMu/mL2.6-D/mL2.6-D/mL1 14.04.0-1.01.02 24.54.50.50.5-3 34.04.01.01.0-4 4和和和和5 53.53.50.50.5-1.01.06 6和和和和7 73.03.01.01.0-1.01.08 8和和和和9 9-1.01.03.03.01.01.0【注意事项】n n叶绿体提

11、取：叶绿体提取：叶绿体提取：叶绿体提取：在冰浴低温条件下操作，在冰浴低温条件下操作，在冰浴低温条件下操作，在冰浴低温条件下操作，上清液和沉淀的保留与否。上清液和沉淀的保留与否。上清液和沉淀的保留与否。上清液和沉淀的保留与否。n n希尔反应希尔反应希尔反应希尔反应:每管反应的总体积相同，且做好标记；每管反应的总体积相同，且做好标记；每管反应的总体积相同，且做好标记；每管反应的总体积相同，且做好标记；在反应时，所加溶液为提取液稀释的叶绿体悬浮液，与测在反应时，所加溶液为提取液稀释的叶绿体悬浮液，与测在反应时，所加溶液为提取液稀释的叶绿体悬浮液，与测在反应时，所加溶液为提取液稀释的叶绿体悬浮液，与测

12、定叶绿体含量时用丙酮稀释不同；定叶绿体含量时用丙酮稀释不同；定叶绿体含量时用丙酮稀释不同；定叶绿体含量时用丙酮稀释不同；光照条件下取放试管时，千万注意不能将水溅到灯泡上光照条件下取放试管时，千万注意不能将水溅到灯泡上光照条件下取放试管时，千万注意不能将水溅到灯泡上光照条件下取放试管时，千万注意不能将水溅到灯泡上（冷水溅到热的灯泡上会引起灯泡爆炸）。（冷水溅到热的灯泡上会引起灯泡爆炸）。（冷水溅到热的灯泡上会引起灯泡爆炸）。（冷水溅到热的灯泡上会引起灯泡爆炸）。【思考与作业】n n解解释释叶叶绿绿体体浓浓度度和和光光照照强强度度对对希希尔尔反反应应有有何影响？何影响？n nDCMU抑制抑制希尔反应活性的机理何在？希尔反应活性的机理何在？n n为为得得到到理理想想的的实实验验结结果果，在在实实验验中中应应注注意意的主要问题何在？的主要问题何在？