5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

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1、【课题背景课题背景】在刑事侦破案件中常需要对样品在刑事侦破案件中常需要对样品DNADNA进行分析，进行分析，PCRPCR技术能快速扩增技术能快速扩增DNADNA片段，在几个小时内复制出上片段，在几个小时内复制出上百万份的百万份的DNADNA拷贝，有效地解决了因为样品中拷贝，有效地解决了因为样品中DNADNA含含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCRPCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。古生物学、基因克隆和基因测序。【目标解读目标解读】1.1.理解理解PCRPCR的原

2、理、条件和反应过程的原理、条件和反应过程2.2.尝试尝试PCRPCR技术与细胞体内技术与细胞体内DNADNA复制的过程复制的过程DNADNA化学组成化学组成P脱氧核糖脱氧核糖含氮碱基含氮碱基组成元素：组成元素：C、H、O、N、P基本单位：脱氧基本单位：脱氧核糖核糖核糖核糖核苷酸核苷酸鸟嘌呤（鸟嘌呤（鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G G G）腺嘌呤（腺嘌呤（腺嘌呤（腺嘌呤（A A A A）胞嘧啶（胞嘧啶（胞嘧啶（胞嘧啶（C C C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T T T）DNADNA全称：脱氧核糖核酸全称：脱氧核糖核酸全称：脱氧核糖核酸全称：脱氧核糖核酸1 12 25 543磷酸基团（

3、在磷酸基团（在 5 的位置上）的位置上）DNA复制的方向复制的方向引物引物DNA母链母链DNADNA的复制方向的复制方向总是从总是从子链的子链的5 5端向端向3 3端端延伸延伸引物从模板链引物从模板链3 3端结合端结合思考：为什么需要引物？因为因为DNADNA聚合酶不能从头开始聚合酶不能从头开始DNADNA复制。复制。DNA DNA聚合酶聚合酶只能从引物只能从引物3 3 端延伸端延伸DNADNA链链（合成子链）。因为（合成子链）。因为DNADNA聚合酶聚合酶只能将新的核只能将新的核苷酸加到已有的苷酸加到已有的DNADNA双链上，双链上，所以所以DNADNA复制需复制需要引物。要引物。从中选出适

4、合的引物进行从中选出适合的引物进行PCR:PCR:(1)CCTAGA (1)CCTAGA (2)GTTCGC(2)GTTCGC(3)AAAGT (3)AAAGT (4)TTTCA(4)TTTCA 3 5 5 3 结论：结论：1 1、引物结合在母链的、引物结合在母链的33端。端。2 2、复制不是从头开始。、复制不是从头开始。3 3、DNADNA聚合酶从引物聚合酶从引物33端开始结合上去端开始结合上去4 4、子链、子链DNADNA延伸的方向从延伸的方向从55到到33（1）CCTAGA（3）TTGAAA1 1、PCRPCR（多聚酶链式反应）技术：（多聚酶链式反应）技术：体外模拟体外模拟DNADNA复

5、制复制的技术。的技术。2 2、原理：、原理：二、二、PCRPCR原理原理利用了利用了DNADNA的热变性的热变性原理，通过控制温度原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。来控制双链的解聚与结合。DNADNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-10080-100 ）复性（复性（缓慢缓慢冷却）冷却）重复重复3030次次1 1 步骤：变性步骤：变性 复性复性 延伸延伸三三 PCRPCR的反应过程的反应过程90 90 以上以上50 50 左右左右72 72 左右左右2 2 体外体外PCRPCR扩增扩增DNADNA的条件：的条件：模板：模板：原料：原料：酶：酶：引物：引物：DNADNA的两条链的

6、两条链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶引物引物、引物、引物在一定的缓冲液中进行在一定的缓冲液中进行严格控制温度严格控制温度模板DNA 3 3 5 5 三三 PCRPCR的反应过程的反应过程 5 50引物引物1 1引物引物2 2 5 5 3 3 5 3 3 95三三 PCRPCR的反应过程的反应过程 5 引物引物1 1引物引物2 2 5 5 3 3 5 3 3 72Taq酶Taq酶子链子链子链子链第第1 1轮结束轮结束第第2 2轮开始轮开始三三 PCRPCR的反应过程的反应过程PCR技术的操作过程1 1、上一次循环的产物作为下一次循环模板上一次循环的产物作为下一次

7、循环模板2 2、DNADNA聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处于两个引处于两个引物之间的物之间的DNADNA序列，序列，使这段固定长度的序列使这段固定长度的序列呈呈指数扩增指数扩增。PCRPCR的反应过程总结：的反应过程总结：循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸预变形预变形预变形预变形94949494C,10minC,10minC,10minC,10min30303030次次次次4444，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次4444，1

8、min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min细胞内细胞内DNA复制与体外复制与体外PCR的技术区别：的技术区别：细胞内复制细胞内复制体外体外PCRPCR技术技术解旋解旋解旋酶解旋酶、ATPATP作用下，作用下，部分解开部分解开高温，全部解开高温，全部解开，不需解旋酶不需解旋酶引物引物2 2种种2 2种种DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶（细胞自身聚合酶（细胞自身的，不耐高温）的，不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶（耐高温）（耐高温）复制特点复制特点半保留复制，半保留复制，边解旋边解旋边复制边复制。半保留复制，半保留复制，完完全解旋后复制全解旋后复制。复制的方复制的方向向子链的子链的5 5端向端向 3 3端端延伸延伸子链的子链的5 5端向端向 3 3端延伸端延伸本节小结本节小结一、一、PCRPCR原理原理DNADNA双链双链变性（加热变性（加热80-10080-100 ）单链单链复性（复性（缓慢缓慢冷却）冷却）二、二、PCRPCR的反应过程的反应过程步骤：变性步骤：变性 复性复性 延伸延伸PCRPCR扩增扩增DNADNA的条件：模板、酶、引物、原料的条件：模板、酶、引物、原料三、细胞内三、细胞内DNADNA复制与复制与PCRPCR技术比较技术比较