生化分析方法(熊).ppt

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1、指导老师：张宏姓名：熊昱什么叫生化分析什么叫生化分析什么叫生化分析，我们可以这样理解：用生物、化学的原理和方法，研究生命现象的分析方法。研究生物体的化学组成、代谢、营养、酶功能、遗传信息传递、生物膜、细胞结构及分子病等等，阐明生命现象。生化分析是进行生命科学研究的一个重要手段，在生物医药研发、临床生化诊断、生化产品生产等领域起着越来越重要的作用，是一门理论与实践相结合的综合性技术。发展进程发展进程从早期对生物总体组成的研究。进展到对各种组织和细胞成分的精确分析。目前正在运用诸如光谱分析、同位素标记、X射线衍射、抗原抗体反应、酶交联的免疫吸附法、其他物理学、化学技术，对重要的生物大分子（如蛋白质

2、、核酸等）进行分析，以期说明这些生物大分子的多种多样的功能与它们特定的结构关联对不同的对象，有不同的分析方法，要达到不同的目的，也要使用不同的分析方法，因此分析方法也就多种多样，在这里我就讲蛋白质的分析方法概述，抛砖引玉氨基酸蛋白质的分析方法生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的氨基酸之间通过氨基和羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。泛指某一类蛋白质，与前面的限定词组成复合词时，一律用“蛋白质”，如血浆蛋白质、纤维状蛋白质、酶蛋白质等，此时“质”字不得省略(习惯词除外，新命名者从此)。凡指具体蛋白质时，“质”字可省略，如血红蛋白、肌球蛋

3、白等。蛋白质四聚体蛋白质四聚体(四级结构四级结构)1.氨基酸类药物分析 药典中氨基酸含量测定大多应用化学滴定法,只有美国药典中乙酰半胱氨酸采用高教液相色谱法(HPLC)。但近年来HPLC已广泛应用于氨基酸分析,其中令人关注的是有关氨基酸的衍生化，因为只有极少数氨基酸具有紫外吸收,大多数氨基酸不能用紫外检测器检测。为改善被测物的 检测特性，提高检测灵敏度，必须采用化学衍生法。目前衍生方法大致有两种：柱前衍生和柱后衍生。1.1柱前衍生法柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLCHPLC分离，衍生化的结果不仅仅改善了被测物的分离，衍生化的结果不仅仅改善了

4、被测物的检测特性，有时对其色谱分离也有一定的帮助检测特性，有时对其色谱分离也有一定的帮助 ，常用常用 衍生化试剂有邻苯二衍生化试剂有邻苯二 甲醛、羟基琥珀酸亚胺甲醛、羟基琥珀酸亚胺一一 吲哚乙酸吲哚乙酸(SIIA)(SIIA)、苯氨基硫代甲酰酯、苯氨基硫代甲酰酯(PTC)(PTC)。有科学家分别用亚硝酸和有科学家分别用亚硝酸和 N N 芘基马来酰亚胺作为芘基马来酰亚胺作为衍生化试剂以紫外和荧光作检测的反相高效液衍生化试剂以紫外和荧光作检测的反相高效液相法相法(R PHPLC)(R PHPLC)定量测定人体内乙酰半胱氨酸，定量测定人体内乙酰半胱氨酸，获得到满意结果。获得到满意结果。1.2柱后衍生

5、法柱后衍生法是将样品先经色谱柱分离，柱后再进行衍生。Nozal等将乙酰半胱氨酸经RPHPLC分离后，用二硫硝基苯酸衍生处理再进行检测，同时加入溴化十六烷基三 甲铵阳离子以增强灵敏度，检测限为0.6g。得到了满意的结果1.3其他衍生方式除了以上两种经典衍生方式外，最近有文献“介绍了用于定量分析氨基酸的一种毛细管柱内衍生方法，可在缓冲液中加入衍生剂(Online法)，也可在毛细管前端的衍生室进行反应(Sandwich法)，这种方法与柱前衍生法检测水平相当(微克级)此外，还可用蒸发光散射检测器直接检测非衍生化的氨基酸，配合HPLC的分离定量，检测限达 纳克级，回收率为9 4%2 酶类分析 酶的种类极

6、多，目前研究发现的酶已达 1300多种，它们都是机体细胞中合成的蛋白质，具有高度的催化作用及选择性；虽为活体产生，但 自活体提出后，仍不失其催化活性个，因此某些酶经提取后，可作 为药用。现有药用酶制剂已达100种，。酶类药物分析基本上还是应用生化反应方法，生酶类药物分析基本上还是应用生化反应方法，生化物质为底物，辅以紫外分光光度法化物质为底物，辅以紫外分光光度法 (UV)(UV)，反映，反映酶解反应的程度酶解反应的程度 ，测定酶效价。映酶解反应的程测定酶效价。映酶解反应的程度度 ，近年来，近年来，人们尝试用一些新的生化反应底人们尝试用一些新的生化反应底物使反应更加灵敏和准确物使反应更加灵敏和准

7、确 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase(Superoxide Dismutase，简称，简称SOD)SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。受损伤。SODSOD广泛存在于各类生物体内，所有好广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有氧微生物细胞中都含有SODSOD。自。自19691969年年MccordMccord等等人首次发现了人首次发现了SODSOD生物活性后，医学界对其医疗生物活性后，医学界对其医

8、疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为家称为2121世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。【酶活测定】在25 4.5ml 50mmolL pH8.3的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmolL的连苯三酚，迅速摇匀，倒入光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma

9、公司的SOD标准品，对所测样品SOD活性进行校正。【酶活定义】在1ml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50时的酶量为一个酶活单位，即325nm 0.035ODmin为一个酶活单位。JonesJones应用硫代氨基甲酰应用硫代氨基甲酰-酪蛋白荧光底物使胰蛋酪蛋白荧光底物使胰蛋白酶、胃蛋白酶的检测灵敏度提高了几十倍；白酶、胃蛋白酶的检测灵敏度提高了几十倍；张东裔等以对甲苯磺酰基精氨酸甲酯张东裔等以对甲苯磺酰基精氨酸甲酯(TAME)(TAME)为底为底物，以物，以 苯酚红指示剂在特定波长下光吸收值的变苯酚红指示剂在特定波长下光吸收值的变化作为测定胰蛋白酶效价的指标，化作为测定胰蛋白酶效价的指

10、标，相对于药典中相对于药典中以消耗氢氧化钠体积为指标，这种方法更加简便以消耗氢氧化钠体积为指标，这种方法更加简便灵敏；灵敏；此外，此外，通通 过选择不同的底物和指示剂过选择不同的底物和指示剂 ，此法还此法还 可用于测定其可用于测定其 它蛋白酶的活性它蛋白酶的活性 ，从而建立一从而建立一 系系列以指示剂为基础的酶活性测定方法。列以指示剂为基础的酶活性测定方法。3 蛋白质多肽类药物分析 3.1蛋白质印记法蛋白质印记法，英文名：（Western blotting）一种分析和鉴定特定蛋白质的技术。即将混杂的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜上，再用标记的抗体或二抗与之反应，以显示膜上特定的

11、蛋白条带 3.2酶联免疫法酶联免疫法，简称ELISA酶联免疫法酶联免疫法，简称ELISA。它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。3.3单克隆抗体检测法单克隆抗体检测法单克隆抗体检测法单克隆抗体检测法。一般用制好的单克隆抗体试剂盒来检测，操作简单，结果准确3.4免疫组化免疫组化免疫组化免疫组化，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(imm

12、unocytochemistry)。3.5荧光光谱法荧光光谱法灵敏度高，复杂组分辨识度好，作为一种常规的检测手段在生物传感方面发挥着其优势，是定量测定蛋白质的常用方法。常用的几种方法是内源荧光法、荧光探针法、荧光偏振、时间分辨荧光法及激光诱导时间分辨免疫分析法。3.51内源荧光法内源荧光法内源荧光法是基于蛋白质中存在着酪氨酸和色氨内源荧光法是基于蛋白质中存在着酪氨酸和色氨酸，能够吸收酸，能够吸收270-300nm270-300nm的紫外光而发出紫外荧的紫外光而发出紫外荧光发展起来的光发展起来的61,6261,62。当测定体系中加入小分。当测定体系中加入小分子配体子配体(SM)(SM)时，时，S

13、MSM与蛋白质发生相互作用，会与蛋白质发生相互作用，会导致蛋白质荧光的碎灭，利用导致蛋白质荧光的碎灭，利用SMSM对蛋白质内源荧对蛋白质内源荧光的碎灭这一现象可以确定蛋白质与光的碎灭这一现象可以确定蛋白质与SMSM的作用类的作用类型及其结合部位等。此法比紫外分光光度法灵敏，型及其结合部位等。此法比紫外分光光度法灵敏，且核酸的干扰较小，来自其他小分子化合物的干且核酸的干扰较小，来自其他小分子化合物的干扰也比较小。扰也比较小。3.52外源荧光法外源荧光法对于蛋白质的研究仅利用其内源荧光是不够的，需要通过对于蛋白质的研究仅利用其内源荧光是不够的，需要通过对于蛋白质的研究仅利用其内源荧光是不够的，需要

14、通过对于蛋白质的研究仅利用其内源荧光是不够的，需要通过外源荧光性质的研究才能获得更多关于蛋白质分子的各种外源荧光性质的研究才能获得更多关于蛋白质分子的各种外源荧光性质的研究才能获得更多关于蛋白质分子的各种外源荧光性质的研究才能获得更多关于蛋白质分子的各种信息，这就使得荧光探针对蛋白质分析有着重要的意义，信息，这就使得荧光探针对蛋白质分析有着重要的意义，信息，这就使得荧光探针对蛋白质分析有着重要的意义，信息，这就使得荧光探针对蛋白质分析有着重要的意义，这已成为蛋白质微量检测及溶液的构相分析中的手段之一。这已成为蛋白质微量检测及溶液的构相分析中的手段之一。这已成为蛋白质微量检测及溶液的构相分析中的

15、手段之一。这已成为蛋白质微量检测及溶液的构相分析中的手段之一。作为一个好的荧光探针应满足以下条件探针分子与蛋白质作为一个好的荧光探针应满足以下条件探针分子与蛋白质作为一个好的荧光探针应满足以下条件探针分子与蛋白质作为一个好的荧光探针应满足以下条件探针分子与蛋白质分子的某一微区必须有特异性的结合，并且结合比较牢固分子的某一微区必须有特异性的结合，并且结合比较牢固分子的某一微区必须有特异性的结合，并且结合比较牢固分子的某一微区必须有特异性的结合，并且结合比较牢固;探针的荧光必须对环境条件敏感探针的荧光必须对环境条件敏感探针的荧光必须对环境条件敏感探针的荧光必须对环境条件敏感;蛋白质分子与探针结合蛋

16、白质分子与探针结合蛋白质分子与探针结合蛋白质分子与探针结合后不影响其原来的结构和特性。在外源荧光法中，又可分后不影响其原来的结构和特性。在外源荧光法中，又可分后不影响其原来的结构和特性。在外源荧光法中，又可分后不影响其原来的结构和特性。在外源荧光法中，又可分为荧光增强法和荧光碎灭法。为荧光增强法和荧光碎灭法。为荧光增强法和荧光碎灭法。为荧光增强法和荧光碎灭法。3.53荧光偏振法荧光偏振法 利用荧光体在转动扩散速度上的差异而导致偏振荧光的差别，建立了利用荧光体在转动扩散速度上的差异而导致偏振荧光的差别，建立了荧光偏振测定法。荧光偏振测定法。利用荧光偏振我们可以研究利用荧光偏振我们可以研究:(1)

17、(1)酶与荧光底物的结合程度酶与荧光底物的结合程度;(2)(2)蛋白质聚合与解离蛋白质聚合与解离;(3)(3)蛋白质从螺旋到无规则卷曲的研究。蛋白质从螺旋到无规则卷曲的研究。另外还可得到一些通常由圆二色谱和紫外可见分光光度计得不到另外还可得到一些通常由圆二色谱和紫外可见分光光度计得不到的有关蛋白质柔性微区的信息的有关蛋白质柔性微区的信息3.54时间分辨荧光光谱法时间分辨荧光光谱法时间分辨荧光光谱是依据待测组分荧光衰减特性的差异而时间分辨荧光光谱是依据待测组分荧光衰减特性的差异而进行选择性测定，可以消除瑞利和拉曼散射的干扰，又可进行选择性测定，可以消除瑞利和拉曼散射的干扰，又可以根据荧光寿命的差

18、异对荧光光谱重叠组分进行测定，为以根据荧光寿命的差异对荧光光谱重叠组分进行测定，为复杂体系的荧光测量提供了选择性基础。时间分辨一荧光复杂体系的荧光测量提供了选择性基础。时间分辨一荧光免疫分析以具有较长荧光寿命的荧光基团作为免疫标记，免疫分析以具有较长荧光寿命的荧光基团作为免疫标记，利用时间分辨荧光测量技术进行测定。一方面可以在荧光利用时间分辨荧光测量技术进行测定。一方面可以在荧光分子定量中获得高灵敏度，另一方面可以通过时间分辨技分子定量中获得高灵敏度，另一方面可以通过时间分辨技术使选择性得到改善，这样就可以定性和定量分析微量蛋术使选择性得到改善，这样就可以定性和定量分析微量蛋白质。白质。3.5

19、5激光诱导时间分辨免疫分析法激光诱导时间分辨免疫分析法在稀土配合物时间分辨荧光光谱和免疫分析的基础上发展起来的激光诱导时间分辨免疫分析法在灵敏度、专一性、稳定性等方面均可与放射免疫分析相媲美，是超微量蛋白质免疫分析的有力手段，已用于人尿中免疫球蛋白G的测定。4仪器分析由于科学的发展，各种物理化学手段的不断提高，许多科学仪器被制作出来，大量复杂的、精确的操作都有科学仪器来完成4.1生化分析仪光电比色原理来测量体液中某种特定化学成分的仪器。由于其测量速度快、准确性高、消耗试剂量小，现已在各级医院、防疫站、计划生育服务站得到广泛使用。配合使用可大大提高常规生化检验的效率及收益。4.11功能及特点功能

20、及特点 自动自动生化分析仪生化分析仪生化分析仪生化分析仪是将生化分析中的取样、加试是将生化分析中的取样、加试剂、去干扰物、混合、保温、比色、结果计算、剂、去干扰物、混合、保温、比色、结果计算、书写报告和清理等步骤的部分或全部由模仿手工书写报告和清理等步骤的部分或全部由模仿手工操作的仪器来完成。它可进行定时法、连续监测操作的仪器来完成。它可进行定时法、连续监测法等各种反应类型的分析测定。除了一般的生化法等各种反应类型的分析测定。除了一般的生化项目测定外，有的还可进行激素、免疫球蛋白、项目测定外，有的还可进行激素、免疫球蛋白、血药浓度等特殊化合物的测定以及酶免疫、荧光血药浓度等特殊化合物的测定以及

21、酶免疫、荧光免疫等分析方法的应用。它具有快速、简便、灵免疫等分析方法的应用。它具有快速、简便、灵敏、准确、标准化、微量等特点敏、准确、标准化、微量等特点 4.12几种生化分析仪流动式自动生化分析仪流动式自动生化分析仪空气分段系统空气分段系统流动式自动生化分析仪流动式自动生化分析仪非分段系统非分段系统分立式自动生化分析仪分立式自动生化分析仪SHF-1型半自动生化分析仪型半自动生化分析仪 4.13蛋白质分析全自动凯氏定氮仪（国家全自动凯氏定氮仪（国家发明专利号发明专利号ZL200710054302.7ZL200710054302.7）使用世界上领先的颜色传感器技术判定滴定终使用世界上领先的颜色传感

22、器技术判定滴定终点技术，该技术与光电管检测方式相比具有终点点技术，该技术与光电管检测方式相比具有终点判断精确、抗干扰能力强、寿命长、无需将滴定判断精确、抗干扰能力强、寿命长、无需将滴定系统置于暗室，操作与观察方便等显著的优点系统置于暗室，操作与观察方便等显著的优点;与与电位滴定检测方式相比具有滴定终点无温度漂移，电位滴定检测方式相比具有滴定终点无温度漂移，无需预热与校准等明显优势。无需预热与校准等明显优势。设计严谨，选材严格，确保测试高精度与高回设计严谨，选材严格，确保测试高精度与高回收率收率 PCPC化，网络化优势，仪器具有化，网络化优势，仪器具有RS232RS232接口接口(标配标配)与无

23、线蓝牙接口与无线蓝牙接口(选配选配)，连接电脑由配套的专用，连接电脑由配套的专用数据处理软件自动生成测试信息和全面的检测报数据处理软件自动生成测试信息和全面的检测报告告,并有增强型的计算机控制软件可供选购并有增强型的计算机控制软件可供选购.k05A自动定氮仪（专利申请号200520000443.7）主要特点：主要特点：主要特点：主要特点：.采用国标规定的检验方法采用国标规定的检验方法 .大屏幕大屏幕LCDLCD显示屏，人性化操作界面，使用舒适显示屏，人性化操作界面，使用舒适方便方便 .自动加吸收液、碱、自动蒸馏，加碱量、加吸收自动加吸收液、碱、自动蒸馏，加碱量、加吸收液量大屏幕显示，设置为体积

24、，单位液量大屏幕显示，设置为体积，单位mlml，并无需，并无需校准，精度高（误差校准，精度高（误差1.5%1.5%），操作方便，一目了），操作方便，一目了然然.自动检测液位和补液自动检测液位和补液 .自动检测液温和预热自动检测液温和预热 .蒸汽检测装置自动监测蒸汽压力，保证工作安全蒸汽检测装置自动监测蒸汽压力，保证工作安全 .试管和安全们自动检测系统，有效防止误操作试管和安全们自动检测系统，有效防止误操作 .循环冷凝水使用德国限流阀，随蒸馏的开启一起循环冷凝水使用德国限流阀，随蒸馏的开启一起动作，自动控制在动作，自动控制在2.5L/2.5L/分。分。.采用采用ABSABS工程塑料机壳，防水、防碱、防电，更工程塑料机壳，防水、防碱、防电，更适合实验室多水与腐蚀的环境。适合实验室多水与腐蚀的环境。