荧光免疫标记技术.ppt
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1、任务八荧光免疫标记技术知识目标技能目标素质目标1.1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在医学检验中的应用医学检验中的应用2.2.熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器和设备和设备3.3.了解荧光抗体的制备了解荧光抗体的制备 1.1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备会使用荧光显微镜等常用仪器和设备2.2.会用荧光免疫技术检测抗原抗体会用荧光免疫技术检测抗原抗体3.3.能将荧光免疫测定与临床应用相联系能将荧光免疫测定与临床应用相联系 通过学生相互鼓励、严谨、认真操作,各小组共同通过学生相互鼓励、严谨、认真操作,
2、各小组共同协作完成任务,培养了与人合作、与人沟通的能力协作完成任务,培养了与人合作、与人沟通的能力 任务目标任务目标1荧光标荧光标记物的记物的制备制备2荧光免荧光免疫组织疫组织化学技化学技术术3其他荧其他荧光免疫光免疫技术技术任务对象任务对象 任务过程任务过程 复习提问复习提问 案例导入案例导入 讲解与示教讲解与示教学生操作学生操作讨论分析讨论分析 评价、考核评价、考核 课后思考题课后思考题 教教学学环环节节2 30 2 10 40 5 1 患儿,男,间断发热五天,伴咳嗽患儿,男,间断发热五天,伴咳嗽患儿,男,间断发热五天,伴咳嗽患儿,男,间断发热五天,伴咳嗽3 3 3 3天。体天。体天。体天
3、。体温最高温最高温最高温最高39393939度,病程第度,病程第度,病程第度,病程第2 2 2 2天查血常规正常,诊天查血常规正常,诊天查血常规正常,诊天查血常规正常,诊断断断断“呼吸道感染呼吸道感染呼吸道感染呼吸道感染”并静滴并静滴并静滴并静滴“阿奇霉素阿奇霉素阿奇霉素阿奇霉素”3 3 3 3天,天,天,天,无明显改变,即而出现咳嗽,为阵发性刺无明显改变,即而出现咳嗽,为阵发性刺无明显改变,即而出现咳嗽,为阵发性刺无明显改变,即而出现咳嗽,为阵发性刺激性咳嗽,少痰,胸片提示:双肺纹理增激性咳嗽,少痰,胸片提示:双肺纹理增激性咳嗽,少痰,胸片提示:双肺纹理增激性咳嗽,少痰,胸片提示:双肺纹理增
4、粗,右上肺片影。复查血常规仍正常。患粗,右上肺片影。复查血常规仍正常。患粗,右上肺片影。复查血常规仍正常。患粗,右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致?儿肺部感染系哪种病原体所致?儿肺部感染系哪种病原体所致?儿肺部感染系哪种病原体所致?如何快速如何快速如何快速如何快速诊断?诊断?诊断?诊断?案例导入案例导入老师纠正老师纠正老师纠正老师纠正点评点评点评点评 学生操作学生操作一位学生一位学生一位学生一位学生操作演示操作演示操作演示操作演示学生分组学生分组学生分组学生分组再操作再操作再操作再操作 【主要试剂与器材主要试剂与器材主要试剂与器材主要试剂与器材】1.1.抗原基质片抗原基
5、质片抗原基质片抗原基质片 固定有核抗原,可采用小鼠肝组织切固定有核抗原,可采用小鼠肝组织切固定有核抗原,可采用小鼠肝组织切固定有核抗原,可采用小鼠肝组织切 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。2.2.标记抗体标记抗体标记抗体标记抗体 FITCFITC标记的羊抗人标记的羊抗人标记的羊抗人标记的羊抗人IgGIgG,有商品化试剂供,有商品化试剂供,有商品化试剂供,有商品化试剂供 应。临用时稀释至工作浓度。应。临用时稀释至工作浓度。应。临用时稀释至工作浓度
6、。应。临用时稀释至工作浓度。3.0.01mol/L pH7.2PBS3.0.01mol/L pH7.2PBS。4.4.缓冲甘油缓冲甘油缓冲甘油缓冲甘油 9 9份甘油和份甘油和份甘油和份甘油和1 1份份份份PBSPBS混匀。混匀。混匀。混匀。5.5.待检血清,阴性、阳性对照血清。待检血清,阴性、阳性对照血清。待检血清,阴性、阳性对照血清。待检血清,阴性、阳性对照血清。6.6.其它其它其它其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。实验操作实验操作【操作方法操作方法】vv1.1
7、.自冰箱中取出抗原基质片,平衡至室温,用记号笔画圈自冰箱中取出抗原基质片,平衡至室温,用记号笔画圈自冰箱中取出抗原基质片,平衡至室温,用记号笔画圈自冰箱中取出抗原基质片,平衡至室温,用记号笔画圈标记。标记。标记。标记。vv2.2.将待检血清和对照血清用将待检血清和对照血清用将待检血清和对照血清用将待检血清和对照血清用PBSPBS作作作作1 1 1010稀释,用微量加稀释,用微量加稀释,用微量加稀释,用微量加样器加样器加样器加样器加50l50l待检血清或对照血清于基质片上,水平置于待检血清或对照血清于基质片上,水平置于待检血清或对照血清于基质片上,水平置于待检血清或对照血清于基质片上,水平置于湿
8、盒中湿盒中湿盒中湿盒中37oC37oC温箱反应温箱反应温箱反应温箱反应30min30min。vv3.3.以以以以PBSPBS冲洗抗原基质片,再分别浸于盛有冲洗抗原基质片,再分别浸于盛有冲洗抗原基质片,再分别浸于盛有冲洗抗原基质片,再分别浸于盛有PBSPBS染色缸染色缸染色缸染色缸中,反复漂洗中,反复漂洗中,反复漂洗中,反复漂洗3 3次,每次次,每次次,每次次,每次5min5min。vv4.4.取出玻片,吹干,加取出玻片,吹干,加取出玻片,吹干,加取出玻片,吹干,加50l50l最适工作浓度的标记抗体,最适工作浓度的标记抗体,最适工作浓度的标记抗体,最适工作浓度的标记抗体,平置于湿盒内,平置于湿盒
9、内,平置于湿盒内,平置于湿盒内,37oC37oC温箱反应温箱反应温箱反应温箱反应30min30min。vv 5.5.重复步骤重复步骤重复步骤重复步骤3 3,洗去未结合的荧光抗体。,洗去未结合的荧光抗体。,洗去未结合的荧光抗体。,洗去未结合的荧光抗体。vv6.6.滴加缓冲甘油封片,用荧光显微镜观察。滴加缓冲甘油封片,用荧光显微镜观察。滴加缓冲甘油封片,用荧光显微镜观察。滴加缓冲甘油封片,用荧光显微镜观察。实验操作实验操作【结果判断结果判断】v1.1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色,为阳性;荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色,为阳性;荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色,为阳性;荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿
10、色,为阳性;反之为阴性。反之为阴性。反之为阴性。反之为阴性。v2.2.根据荧光分布情况,可分为四种荧光核型:根据荧光分布情况,可分为四种荧光核型:根据荧光分布情况,可分为四种荧光核型:根据荧光分布情况,可分为四种荧光核型:v均质型均质型均质型均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。细胞核呈均匀一致的荧光。细胞核呈均匀一致的荧光。细胞核呈均匀一致的荧光。v周边型周边型周边型周边型:细胞核周围呈现荧光,核中央染色弱或细胞核周围呈现荧光,核中央染色弱或细胞核周围呈现荧光,核中央染色弱或细胞核周围呈现荧光,核中央染色弱或无荧光。无荧光。无荧光。无荧光。v斑点型:细胞核呈现斑点状荧光。斑点型:细胞核呈现斑点状荧
11、光。斑点型:细胞核呈现斑点状荧光。斑点型:细胞核呈现斑点状荧光。v核仁型:核仁部分呈现荧光。核仁型:核仁部分呈现荧光。核仁型:核仁部分呈现荧光。核仁型:核仁部分呈现荧光。实验操作实验操作实验操作实验操作 实验操作实验操作【注意事项注意事项】v1.1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内,样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内,样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内,样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内,防止干燥。防止干燥。防
12、止干燥。防止干燥。v2.2.每次冲片应彻底,防止非特异荧光的干扰。每次冲片应彻底,防止非特异荧光的干扰。每次冲片应彻底,防止非特异荧光的干扰。每次冲片应彻底,防止非特异荧光的干扰。v3.3.荧光受温度影响较大,不能及时观察时应注荧光受温度影响较大,不能及时观察时应注荧光受温度影响较大,不能及时观察时应注荧光受温度影响较大,不能及时观察时应注意低温避光保存。意低温避光保存。意低温避光保存。意低温避光保存。实验操作实验操作【应用与评价应用与评价】v荧光抗体技术应用较广,可用于病原微生物鉴定荧光抗体技术应用较广,可用于病原微生物鉴定荧光抗体技术应用较广,可用于病原微生物鉴定荧光抗体技术应用较广,可用
13、于病原微生物鉴定及其抗体的检测;自身免疫病自身抗体的检测,及其抗体的检测;自身免疫病自身抗体的检测,及其抗体的检测;自身免疫病自身抗体的检测,及其抗体的检测;自身免疫病自身抗体的检测,免疫细胞表面抗原的检测等。免疫细胞表面抗原的检测等。免疫细胞表面抗原的检测等。免疫细胞表面抗原的检测等。v此方法检测此方法检测此方法检测此方法检测ANAANA,主要用于初步筛查,具有简便、,主要用于初步筛查,具有简便、,主要用于初步筛查,具有简便、,主要用于初步筛查,具有简便、快速、敏感等特点。快速、敏感等特点。快速、敏感等特点。快速、敏感等特点。实验操作实验操作讨论分析讨论分析提提 出出 问问 题题展展 开开
14、讨讨 论论 用什么可以用什么可以用什么可以用什么可以观察到荧光观察到荧光观察到荧光观察到荧光?为什么有荧为什么有荧为什么有荧为什么有荧光就能做出光就能做出光就能做出光就能做出诊断?诊断?诊断?诊断?免疫荧光技术(免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术。它是在免)又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。立起来的一项技术。v该技术的主要优缺点该技术的主要优缺点该技术的主要优缺点该技术的主要优缺点v主要优点:特异性强、敏感性高、速度快。主要优点:特异性强、敏感性高、速度快。主
15、要优点:特异性强、敏感性高、速度快。主要优点:特异性强、敏感性高、速度快。v主要缺点:非特异性染色问题尚未完全解主要缺点:非特异性染色问题尚未完全解主要缺点:非特异性染色问题尚未完全解主要缺点:非特异性染色问题尚未完全解 决,决,决,决,结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。免疫荧光技术免疫荧光技术讨论分析讨论分析 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显
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