X3-1-2基因工程的基本操作程序.ppt

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1、1.2 1.2 基因工程的基因工程的基本操作程序基本操作程序专题专题1 1 基因工程基因工程1 1基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序v目的基因的获取目的基因的获取v基因表达载体的构建基因表达载体的构建v将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞v目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定2 23 3编码区编码区编码区编码区非非非非编码区编码区编码区编码区非非非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游编码区下游编码区下游 终止子终止子终止子终止子启动子启动子启动子启动子与与与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点聚合酶结合位点聚合酶结

2、合位点补：补：原核原核细胞的基因结构细胞的基因结构编码区编码区：非编码区非编码区：编码蛋白质编码蛋白质，连续不间断连续不间断不编码蛋白质，有调控作用不编码蛋白质，有调控作用4 4编码区编码区编码区编码区非非非非编码区编码区编码区编码区非非非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游编码区下游编码区下游 终止子终止子终止子终止子启动子启动子启动子启动子与与与与RNARNA聚酶结合位点聚酶结合位点聚酶结合位点聚酶结合位点补：补：真真核核细胞的基因结构细胞的基因结构外显子外显子内含子内含子不编码蛋白质，有调控作用不编码蛋白质，有调控作用编码区编码区：非编

3、码区非编码区：外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列5 5结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰成熟成熟mRNA6 6 关于内含子和外显子的说法正确的是关于内含子和外显子的说法正确的是关于内含子和外显子的说法正确的是关于内含子和外显子的说法正确的是 （）A.A.内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成 熟的熟的熟的熟的mRNAmRNAB.B.只有外显子能够转录成只有外显

4、子能够转录成只有外显子能够转录成只有外显子能够转录成mRNAmRNA，tRNAtRNA，rRNArRNAC.C.原核细胞基因中也有内含子和外显子原核细胞基因中也有内含子和外显子原核细胞基因中也有内含子和外显子原核细胞基因中也有内含子和外显子D.D.由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区B7 7一、目的基因的获取一、目的基因的获取（指编码蛋白质指编码蛋白质结构基因结构基因）鸟枪法鸟枪法供体供体DNADNADNADNA片段片段目的基因目的基因逆转录法逆转录法信使信使RN

5、ARNA目的基因目的基因化学合成法化学合成法肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因基因DNADNA序列序列目的基因目的基因合成合成推测推测逆转录逆转录合成合成直接提取法（原核生物）直接提取法（原核生物）人工合成法（真核生物）人工合成法（真核生物）8 8三种目的基因提取的方法有何优缺点？三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转反转录法录法化学合化学合成法成法操作简便，广泛使用操作简便，广泛使用操作简便，广泛使用操作简便，广泛使用工作量大，盲目，分离出工作量大，盲目，分离出工作量大，盲目，分离出工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因来的有时并非一

6、个基因来的有时并非一个基因来的有时并非一个基因专一性强，目的基因专一性强，目的基因专一性强，目的基因专一性强，目的基因中不含不表达部分中不含不表达部分中不含不表达部分中不含不表达部分操作过程麻烦，操作过程麻烦，操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很很很很不稳定，要求的技术条件不稳定，要求的技术条件不稳定，要求的技术条件不稳定，要求的技术条件较高较高较高较高专一性最强，目的基因专一性最强，目的基因专一性最强，目的基因专一性最强，目的基因中不含不表达部分，可中不含不表达部分，可中不含不表达部分，可中不含不表达部分，可合成自然界中不存在的合成自然界中不存在的合成自然界中不存在的合成自然界中不

7、存在的基因基因基因基因仅限于合成核苷酸对较仅限于合成核苷酸对较仅限于合成核苷酸对较仅限于合成核苷酸对较少的简单基因少的简单基因少的简单基因少的简单基因9 9从基因文库中提取目的基因从基因文库中提取目的基因1 1 基因文库基因文库(gene library)(gene library)概念概念n又称又称DNADNA文库，是指某个生物的基因组文库，是指某个生物的基因组DNADNA或或cDNAcDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落到大量的阳性菌落(或噬菌体或噬菌体)，所有

8、菌落或，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。噬菌体的集合即为该生物的基因文库。n基因文库由外源基因文库由外源DNADNA片段、载体和宿主组成。片段、载体和宿主组成。1010基因文库的分类基因文库的分类按照外源按照外源DNADNA片段的来源：片段的来源：u从特定组织提取的染色体基因组从特定组织提取的染色体基因组DNADNA-基因组基因组DNADNA文库文库（总）（总）umRNAmRNA反转录成的反转录成的cDNAcDNA拷贝拷贝-cDNAcDNA文库文库（部分）（部分）基因文库的目的基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。下，便

9、于获得所需的目的基因。1111基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库1212基因组基因组DNADNA文库文库限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装基因组文库基因组文库 (Genomic library)(Genomic library)是指将某种生物体的全部基是指将某种生物体的全部基因组因组DNA用限制性内切酶或机械用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为所有

10、阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。物的全部基因。1313cDNAcDNA文库文库 (cDNAcDNA library)library)n是指将某种生物体基因组转录的全部是指将某种生物体基因组转录的全部mRNAmRNA经反转录产生的经反转录产生的cDNAcDNA片段分别与克隆载体片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的该生物基因组的cDNAcDNA文库。文库。ncDNA(complementarycDNA(comple

11、mentary DNA DNA，互补，互补DNA)DNA)：是：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的胞内的mRNAmRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNADNA。1414cDNAcDNA文库的构建文库的构建反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNAcDNAcDNA文库文库 (cDNAcDNA library)library)基因重组基因重组单链单链DNADNARNARNADNADNA杂交链杂交链1515基因组基因组DNA文库与文库与cDNA文库的比较文库的比较1616cDNAcDNA文库和基因组文库对比表文库和基因组文库对

12、比表文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因 某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以目的性强比较盲目工作量相对小大1717u基因文库基因文库中不是直接保管相中不是直接保管相应基因，而是应基因，而是保存受体菌保存受体菌，菌，菌中含基因中含基因1818利用利用PCRPCR提取目的基因提取目的基因PCRPCR：是一项在生物：是一项在生物体外体外复制特定复制特定DNADNA片段片段的核酸合成技术。的核酸合成技术。原理：原理：DNADNA双链复制双链复制原料：模板原料：模板DNADNA；DNADNA引物；四种脱氧核苷引物；四种脱氧核

13、苷酸；热稳定酸；热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）；离子酶）；离子1919PCR的基本原理的基本原理n类似于类似于DNA的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增DNA模模板加热板加热变性变性解链，随之将反应混合物冷却至解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生发生退火退火，再将温度升高使退火引物在，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以聚合酶作用下得以延伸延伸。这种热。这种热变性复性变性复性延伸延伸的过程就是一个的过程就是一个PCR循环，循环，PCR就是就是在合适条件下的这种循环的不断重复。在合适条件

14、下的这种循环的不断重复。2020n模板模板DNA（已知碱基序列已知碱基序列）n 特异性引物（特异性引物（DNA）n耐热耐热DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）n dNTPs（4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸）nMg+(促进促进dNTP与核酸骨架作用与核酸骨架作用)PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分2121PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性90-95C延伸延伸70-75C退火退火55-60C第三步：将反应体系升温第三步：将反应体系升温至至7075，在耐高温的，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的酸加到引物所

15、提供的3-OH上，使上，使DNA链延伸合成链延伸合成，产生一条与模板链互补的产生一条与模板链互补的DNA链。链。第一步：将反应体系（包括双链模第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的板、引物、耐高温的DNA聚合酶、聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至所需的离子等）加热至9095，使双链使双链DNA模板两条链之间的模板两条链之间的氢键氢键打开，变成单链打开，变成单链DNA，作为互补链，作为互补链聚合反应的模板。聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温第二步：将反应体系降温至至5560，使，使两种引两种引物分别与模板物分别与模板DNA链配对

16、链配对结合结合，这个过程称为复性。，这个过程称为复性。2222引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNADNADNA片段片段片段片段2323模板模板模板模板DNADNADNADNA959553355335变性变性24245555533555AB引物引物引物引物AB退火退火25257272533555Taq酶酶延伸延伸126267272533555延伸延伸227277272949494945555PCRPCR循环循环循环循环29291234522557294时间（min）温度（）PCRPCR反应反应PCR反应条件PCR过程PCR

17、的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍3030模板DNA953131PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物3232PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶3333PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束第2轮开始3434PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaq3535PCR的基本原理n

18、PCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束3636PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点重复重复3030轮后轮后2 23030=1,073,741,824=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 3737利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3838靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步：加热变性循环第一步：加热变性3939靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶

19、序列靶序列引物引物引物引物 引物引物引物引物 55553333555555553333555533333333PCR PCR 循环第二步：引物与靶序列退火循环第二步：引物与靶序列退火4040靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物引物引物引物引物55553 3 3 3555555553333555533333333TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步：引物延伸循环第三步：引物延伸4141靶序列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后：得到两个拷贝的循环完成

20、后：得到两个拷贝的靶序列靶序列4242QPCR是针对特定是针对特定DNA片断片断的快速体外复制增殖技术的快速体外复制增殖技术Q每循环一轮，目的基因的每循环一轮，目的基因的量可增加一倍量可增加一倍Q增殖速率为增殖速率为2n,（n为循环为循环次数）次数）每完成一个循环需每完成一个循环需2-42-4分钟，分钟，2-32-3小时就小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。4343PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，断裂，形成断裂，形成 。b b、复性（复性（

21、55-6055-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部 。c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的 。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链4444q从基因文库中获取从基因文库中获取q利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增q利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法DNADNADNADNA合成仪合成仪合成仪合成仪DNADNADNADNA序列自动测

22、序仪序列自动测序仪序列自动测序仪序列自动测序仪PCRPCRPCRPCR扩增仪扩增仪扩增仪扩增仪4545基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心质粒质粒DNADNA分子分子一个一个一个一个切口切口两个两个两个两个黏性末端黏性末端两个两个两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。上是不同来源的基因重组的过程。4646构建表达载体构建表达载体组成组成q目的基因目的基因q启动子启动子q终止子终止子q标

23、记基因标记基因目的：目的：使目的基因在受使目的基因在受体细胞中稳定存在；可体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥的基因能够表达和发挥作用。作用。复制原点复制原点插入基因插入基因终止子终止子抗生素抗性基因抗生素抗性基因表达载体表达载体启动子启动子4747方法：方法：同种限制酶分别切割载体和同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用目的基因，再用DNADNA连接酶把两者连接酶把两者连接。连接。条件：条件：同种限制酶、同种限制酶、DNADNA连接酶、连接酶、ATPATP（目的基因、启动子、终止子、（目的基因、启动子、终止子、标记基因）标记基因）4848载体与表达

24、载体的区别：二者都有载体与表达载体的区别：二者都有标记基因标记基因和和复制原点复制原点两部分两部分DNADNA片段。片段。表达载体表达载体在载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因目的基因、启动子启动子、终止子终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：既用到用到的工具酶：既用到限制酶限制酶切割载体，又切割载体，又用到用到DNADNA连接酶连接酶将目的基因和载体拼接，两种将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是酶作用的化学键都是磷酸二酯键磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以目的基因不能单独进入受体细胞，必需

25、以表表达载体达载体的方式携带进去。的方式携带进去。注意注意4949将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞n导入植物细胞导入植物细胞（表达载体导入农杆菌，再（表达载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞）让农杆菌感染植物细胞）5050将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞n农杆菌转化法农杆菌转化法n基因枪法基因枪法n花粉管通道法花粉管通道法5151将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞n显微注射法显微注射法（将基因表达载体（将基因表达载体提纯，用显微仪提纯，用显微仪注射到受精卵中）注射到受精卵中）5252例、采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，

26、人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是A.人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等 于凝血因子氨基酸数目的3倍B.可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组 DNA分子导入羊的受精卵C.在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细 胞，而不存在于其他细胞中D.人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分 子的一条链为模板合成mRNA5353将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2处理受体处理受体细胞成为感受细胞成为感受态细胞，再进态细胞，再进行混合。行混合。将细菌用将细菌用将细菌用将细菌用CaClCaCl2 2处理，以增大细菌处理，以增大细菌处理，以增

27、大细菌处理，以增大细菌细胞壁细胞壁细胞壁细胞壁和和和和细细细细胞膜胞膜胞膜胞膜的的的的通透性通透性通透性通透性。5454目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定n检测检测:q是否插入目的基因是否插入目的基因q是否转录是否转录q是否翻译是否翻译n鉴定鉴定:q功能活性鉴定功能活性鉴定q抗性鉴定抗性鉴定5555DNA分子杂交技术分子杂交技术DNA-RNA分子杂交技术分子杂交技术抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术检验受体细胞染色体的检验受体细胞染色体的DNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检验目的基因是否转录检验目的基因是否转录出了出了mRNA检验目的基因是否表达检验目的基因是否表达出了蛋白质出

28、了蛋白质个体生物学检验个体生物学检验个体生物学性状观察个体生物学性状观察5656DNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd5757检测是否插入检测是否插入目的基因目的基因，利用，利用DNADNA分子杂交技术分子杂交技术，目的基因，目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNADNA杂交，看是否有杂交，看是否有杂交带。杂交带。检测是否转录出了检测是否转录出了mRNAmRNA，利用，利用DNADNA分子杂交技术，分子杂

29、交技术，目的基因目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNAmRNA杂交，看是否有杂交，看是否有杂交带。杂交带。检测目的基因是否翻译成检测目的基因是否翻译成蛋白质蛋白质。抗体与蛋白质进行。抗体与蛋白质进行抗原抗原抗体抗体杂交，看是否有杂交带。杂交，看是否有杂交带。还可以进行还可以进行个体水平个体水平的鉴定，根据其的鉴定，根据其性状性状。提示：提示：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术首先提取受体细胞中的首先提取受体细胞中的DNADNA，然后高温解成，然后高温解成单链，再与同位素标记的单链，再与同位素标记的DNADNA探针杂交；探针杂交；抗原抗

30、体杂交抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。5858大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。检测出来。将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。保留

31、有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物5959归纳归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译60601.下表关于基因工

32、程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作的名的名词词及及对应对应的内容，正确的的内容，正确的组组合是合是2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.B.C.D.A.B.C.D.61613.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B

33、有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接4.4.有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料62625.5.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分 A A启动子启动子 B B终止密码终止密码 C C标记基因标记基因 D D目的基因目的基因6.6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植

34、物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法 A A基因枪法基因枪法 B B显微注射法 C C农杆菌转化法农杆菌转化法 D D花粉管通道法花粉管通道法6363 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg100Kg胰腺只能提取胰腺只能提取4-5g4-5g的胰岛素，其产的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。量之低和价格之高可想而知。假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出人的胰岛素，想一想，如何设计？生产出人的胰岛素，想一想，如何设计？尝试设计

35、尝试设计 64641.答：答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；序列导入受

36、体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。思考与探究思考与探究（P15P15）65652.

37、解析：解析：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属属643种种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。子叶植物也有侵染能力。根瘤农杆菌侵染植物是一

38、个非常复杂的过程。根瘤农杆菌根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还

39、发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。的加工和转移，从而侵染植物细胞。6666 需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子

40、叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向

41、植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转转移并插入到染色体移并插入到染色体DNA上。上。67673.解析：解析：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。这种糖

42、蛋白是不可能的。68684.解析：解析：基本操作如下：基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。（2）将）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。6969