外周血提取DNA及DNA电泳检测.ppt

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1、实验二十五实验二十五真核基因组真核基因组DNADNA分离纯化分离纯化外周血白细胞提取外周血白细胞提取DNADNA（NaINaI法）法）实验二十五实验二十五NaI法提取外周血白细胞法提取外周血白细胞DNA学时数：3教学目的教学目的:掌握NaI法提取外周血白细胞DNA的原理和方法。教学重点教学重点:实验原理与过程教学难点教学难点:实验原理与方法使用教具使用教具:多媒体教学方法教学方法:互动式、讨论式教学法讲授内容纲要、要求及时间分配讲授内容纲要、要求及时间分配导入：（用一部著名电影导入正题，激发学生探索生命奥秘的兴趣）12min交代正题：NaI法提取外周血白细胞DNA1min（一）实验目的（简明扼

2、要）1min（二）实验原理（提出问题，学生阅读，在问题中理解实验原理）1214min（三）实验材料3min（四）实验步骤（思路清晰，结合原理讲解）1516min（五）注意事项2min（六）实验报告1min引言：引言：1min1min 美国好莱坞电美国好莱坞电影影侏罗纪公园侏罗纪公园总票房超过总票房超过3 3亿美亿美元同时也创造了一元同时也创造了一种大胆的科学设想：种大胆的科学设想：一只蚊子吸取了恐一只蚊子吸取了恐龙的血液，蚊子恰龙的血液，蚊子恰巧又被琥珀完美保巧又被琥珀完美保存至今日，科学家存至今日，科学家因此获取了恐龙的因此获取了恐龙的DNADNA，再现了恐龙再现了恐龙时代。时代。真核基因组

3、真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化回忆理论知识回忆理论知识1.真核生物的核酸类型和分布真核生物的核酸类型和分布2.真核生物真核生物DNA的结构的结构核酸的分离纯化核酸的分离纯化（一）原则：原则：保证核酸一级结构的完整；排除蛋白质、脂类、多糖等其他分子的污染；无其他核酸分子的污染。（二）步骤：步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。NaINaI法提取外周血白细胞法提取外周血白细胞DNADNA 实验目的：实验目的：掌握掌握NaI法提取外周血白细胞法提取外周血白细胞DNADNA的原理和方

4、法。的原理和方法。用用NaINaI法提取白细胞中的法提取白细胞中的DNADNA可用于可用于SouthernSouthern杂交、杂交、PCRPCR等。等。例如做亲子鉴定可从一根毛发、一滴血、例如做亲子鉴定可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的甚至一个细胞中扩增出足量的DNADNA供分析研究供分析研究和检测鉴定。和检测鉴定。1.NaI起什么作用？起什么作用？2.如何将如何将DNA从蛋白质中释放出来？从蛋白质中释放出来？思考：思考：实验原理：实验原理：从全血制备白细胞从全血制备白细胞DNADNA，可用可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及

5、细胞核，使核酸处于易提取状态，白及细胞核，使核酸处于易提取状态，加加NaINaI破核膜并使破核膜并使DNADNA从核蛋白中解离从核蛋白中解离，用氯仿用氯仿/异戊异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全，醇抽提使蛋白质沉淀完全，DNADNA存在于上层水存在于上层水相中，以异丙醇沉淀相中，以异丙醇沉淀DNADNA，离心弃去异丙醇，离心弃去异丙醇，并重复操作一次，即可获得白细胞并重复操作一次，即可获得白细胞DNADNA。实验材料实验材料1.器材（1）高速冷冻离心机。（2）自动移液器。（3）枪头、1.5ml离心管（高压灭菌）2.试剂（1）6mol/LNaI (2)氯仿/异戊醇（24:1V/V）(3)纯异丙醇（AR）

6、（4）37%异丙醇（5）双蒸水（高压灭菌）（6）TE缓冲液（PH8.0）高压灭菌1.1.取消毒取消毒EPEP管，做好标记，取外周抗凝血（全血）管，做好标记，取外周抗凝血（全血）100ul100ul于于EPEP管中，以管中，以10000rpm10000rpm离心离心1min 1min。2.2.弃上清，加双蒸水弃上清，加双蒸水200ul200ul溶解，摇匀溶解，摇匀20s20s。（。（破红细破红细胞、白细胞膜）胞、白细胞膜）3.3.混匀后加混匀后加6M 6M NaINaI溶液溶液200ul200ul，缓慢摇匀缓慢摇匀20s20s。（。（破核破核膜膜,使使DNADNA从核蛋白中解离从核蛋白中解离）4

7、.4.加入氯仿加入氯仿/异戊醇（异戊醇（241241）400ul400ul，边加边摇，摇匀边加边摇，摇匀20s20s，12000rpm12000rpm离心离心12min12min。实验步骤实验步骤（思考：每个步骤的作用？）（思考：每个步骤的作用？）7.7.弃弃3737异丙醇，敞开异丙醇，敞开EPEP管盖管盖,倒扣在滤纸上将倒扣在滤纸上将3737异丙醇吸干异丙醇吸干,或放在超净台上吹干，加或放在超净台上吹干，加1xTE1xTE溶液溶液30ul30ul，溶解溶解DNADNA12h12h以上，制成的以上，制成的DNADNA液以液以琼脂糖凝胶电泳鉴定或琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20-20冰箱保存。冰箱保存

8、。5.5.取上层液取上层液360ul360ul，加入另一新加入另一新EPEP管中，加管中，加0.60.6倍体积异丙醇，摇匀倍体积异丙醇，摇匀20s20s，室温放置室温放置15min15min，静静置后的反应体系置后的反应体系14000rpm14000rpm离心离心12min12min，使沉淀使沉淀紧贴紧贴EPEP管壁。管壁。6.6.弃异丙醇，加弃异丙醇，加3737异丙醇异丙醇1ml1ml（不振动），不振动），以以14000rpm14000rpm离心离心12min12min。2.2.混匀试剂、吸取上清等操作时避免动作剧烈。混匀试剂、吸取上清等操作时避免动作剧烈。3.3.弃异丙醇时动作应轻，切忌甩

9、干，以免弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNADNA丢失。丢失。4.DNA4.DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要规需要70%70%的乙醇漂洗的乙醇漂洗DNADNA沉淀物。沉淀物。注意事项：注意事项：1.1.标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用用EPEP管、吸嘴等器物及管、吸嘴等器物及ddHddH2 2O O、试剂等应高压试剂等应高压灭菌，操作尽量在灭菌，操作尽量在44以下进行。以下进行。实验题目实验题目实验目的实验目的实验原理实验原理实验仪器实验仪器实验步骤实验步骤实验过程及实验数据记录实验过程及实验数据记录实验数据处理与分析，并得出结论实验数据处理与分析，并得出结论 实验报告实验报告 时间：时间：年年 月月 日日 思考题：思考题：1.分离纯化核酸的原则是什么？分离纯化核酸的原则是什么？2.NaI法提取外周血白细胞法提取外周血白细胞DNA时应注意哪些问题？时应注意哪些问题？愿我们一起在学习中快乐成长愿我们一起在学习中快乐成长