氨基酸纸层析.ppt

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1、2022/12/291实实 验验 一一氨基酸纸层析氨基酸纸层析 2022/12/292 1 1、通过氨基酸的分离，学习并、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层掌握纸层 析的原理和操作技术；析的原理和操作技术；2 2、掌握分配层析法；、掌握分配层析法；3 3、掌握影响分配系数的因素。、掌握影响分配系数的因素。一、实验目的：一、实验目的：2022/12/293层析技术层析技术(chromatography 色谱技术色谱技术)一、发展史一、发展史：层析分离技术在层析分离技术在2020世纪初就已得到应用：世纪初就已得到应用：19031903年年用用于于植植物物色色素素的的分分离离,各各种种色色素素以以不不

2、同同的的速速率率流流动动后后形形成成不不同的色带而被分开，由此得名为同的色带而被分开，由此得名为“色谱法色谱法”19311931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；19441944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析；年出现了以滤纸作为支持物的纸层析；2020世纪六十年代末出现了高效液相色谱世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)(HPLC)。2022/12/294二、定义二、定义 层析技术层析技术是根据被分离的混合物中各组分的是根据被分离的混合物中各组分的理理化性质化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、（分子的形状和大小、分子极性、吸

3、附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两相（一相为固定的，称为相（一相为固定的，称为固定相固定相；另一相流过固定；另一相流过固定相，称为相，称为流动相流动相）中进行分配。）中进行分配。层析的基本概念层析的基本概念2022/12/295l 固定相固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。l 流动相流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。层析的基本概念层析的基本概念202

4、2/12/296三、层析技术的种类三、层析技术的种类l1 1、按流动相的状态分类：、按流动相的状态分类：（1 1）液相层析（色谱）液相层析（色谱）（2 2）气相层析（色谱）；）气相层析（色谱）；l2 2、按固定相的使用形式分类：、按固定相的使用形式分类：（1 1）柱层析（）柱层析（2 2）纸层析（）纸层析（3 3）薄层层析；）薄层层析；l3 3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：（1 1）吸附层析）吸附层析 （2 2）分配层析分配层析 （3 3）离子交换层析）离子交换层析 （4 4）凝胶层析）凝胶层析 （5 5）亲和层析等。）亲和层析等。2022/

5、12/297 纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析分配层析。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相固定相，通常把有机溶剂作为通常把有机溶剂作为流动相流动相。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点氨基酸分离开来，形成距原点不等

6、的层析点二、实验原理二、实验原理:2022/12/298分配层析法：分配层析法：利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系分配系数数是一个常数。是一个常数。溶质在溶质在固定相固定相的浓度的浓度(Cs)(Cs)分配系数分配系数=溶质在溶质在流动相流动相的浓度（的浓度（Cl)Cl)2022/12/299溶剂系统：溶剂系统：正丁醇：甲酸：水正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固固定定相相：水

7、水和和滤滤纸纸纤纤维维素素有有较较强强的的亲亲和和力力，因而其扩散作用降低形成因而其扩散作用降低形成固定相固定相;流流动动相相：有有机机溶溶剂剂和和滤滤纸纸亲亲和和力力弱弱，所所以以在在滤纸毛细管中自由流动，形成滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。流动相。由由于于混混合合液液中中各各种种氨氨基基酸酸的的值值不不同同，所所以以移移动动速速率率（即即迁迁移移率率R Rf f值值）就就不不同同，从从而而达达到分离的目的。到分离的目的。2022/12/2910 移动速率移动速率(比移值比移值)：原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离 Rf =原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离2022/12/

8、2911影响影响Rf值的主要因素：值的主要因素：R Rf f决定于被分离物质在两相间的分配系数以及决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，质分配系数不同，R Rf f也就不同。也就不同。（1 1）物质的结构和分子极性：）物质的结构和分子极性：物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间就不同，物质的极性决定了物质在水和有机

9、溶剂之间的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，R Rf f小；反之小；反之,R,Rf f则较大。则较大。2022/12/2912（2 2）层析溶剂：）层析溶剂：首先，溶剂的纯度要高。首先，溶剂的纯度要高。其其次次，溶溶剂剂系系统统选选择择应应考考虑虑被被分分离离的的物物质质在在溶溶剂剂系系统统中中的的R Rf f在在0.050.050.850.85。再再次次，溶溶剂剂系系统统必必须须新新鲜鲜配配制制，如如正正丁丁醇醇-甲甲酸酸-水水系系统统久久放易引起酯化。放易引起酯化。（3）pH值：值：溶剂、滤纸和样品的溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离

10、，从而影响物质值都会影响物质的解离，从而影响物质的的极性和溶解度极性和溶解度，使，使Rf改变；改变；2022/12/2913（4 4）滤纸：）滤纸：层析滤纸由高纯度棉花制成，层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，水的量不一样，两相的体积比也就不同，R Rf f也不同；也

11、不同；另外，滤纸的杂质也会影响另外，滤纸的杂质也会影响R Rf f，必要时进行预处，必要时进行预处理（可用理（可用0.010.010.4M0.4M的的HClHCl处理除去金属离子）处理除去金属离子）.2022/12/2914（5 5）室验室的温度和时间）室验室的温度和时间:温度影响物质在两相中的溶解度，即影响温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用从而影响也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积固定相的体积；也影；也影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。层层析必须在恒温条件下进行。析必须在恒温条件下进行

12、。2022/12/2915（6 6）展开方式：）展开方式：上行法上行法R Rf f小；小；下行法下行法（层析缸上部有一盛展开剂（层析缸上部有一盛展开剂的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散）易扩散）R Rf f大大；环行法环行法（最好用无方向性的特制滤纸）（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，的流动，R Rf f较小。较小。（7 7）样品溶液中杂质：）样品溶液中杂质：如氯化钠的存在会影响氨基酸的如氯化钠的存在会影响氨基酸的R Rf f值。值。20

13、22/12/29161、实验材料：、实验材料：谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品2、仪器：、仪器：(1)毛细管毛细管(2)电热吹风机电热吹风机(3)层析缸层析缸(4)层析滤纸层析滤纸 (5)小型玻璃喷雾器小型玻璃喷雾器(6)铅笔、直尺等。铅笔、直尺等。3、试剂：、试剂：(1)氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、组氨酸标准品。组氨酸标准品。(2)溶剂系统：溶剂系统：正丁醇：甲酸：水正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（体积比）摇匀；(3)显色剂：显色剂：0.25%的茚三酮丙酮溶液。的茚三酮丙酮溶液。三、实

14、验材料、仪器和试剂：三、实验材料、仪器和试剂：2022/12/29171 1、样品的准备：、样品的准备：称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各1mg1mg混合溶于混合溶于10%10%异丙醇中，异丙醇中，0.01M0.01M。2 2、滤纸的准备：、滤纸的准备：取一长方形滤纸，在滤纸横向对应的两边，距边沿取一长方形滤纸，在滤纸横向对应的两边，距边沿2cm2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔样线，在点线上每隔2cm2cm画一个画一个“+”作为点样位置，共作为点样位置，共5 5个点

15、。个点。四、实验步骤：四、实验步骤：2022/12/29182022/12/2919 3 3、点样：、点样：用用毛毛细细管管点点样样，中中间间点点混混合合氨氨基基酸酸，两两侧侧点点四四种种标标准准氨氨基基酸酸；每每个个，每每点点一一次次用用晾晾干干后后再再点点下下次次，点点样样点点的的直直径径应应控控制制在在2mm2mm左左点点样样点点重重复复点点5 5次次右右，点点样样完毕用大头针将滤纸做成完毕用大头针将滤纸做成筒形筒形，点样面向外。，点样面向外。2022/12/29202022/12/29212022/12/29224 4、展层：、展层：向向层层析析缸缸中中加加入入层层析析溶溶剂剂，液液面

16、面不不要要超超过过点点样样线线，（高高约约1.5cm1.5cm，约约50ml50ml溶溶剂剂）将将滤滤纸纸点点样样点点朝朝下下放放入入层层析析溶溶剂剂中中，将将层层析析缸缸密密闭闭，待待溶溶剂剂到到达达标标志志线线后后取取出出冷风吹干。冷风吹干。5 5、显色、显色：用用喷喷雾雾器器将将0.250.25茚茚三三酮酮显显色色剂剂均均匀匀喷喷在在滤滤纸纸上上，热风（加快反应）反应吹干显色。热风（加快反应）反应吹干显色。2022/12/2923五、实验结果与计算：五、实验结果与计算：1 1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；2 2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿

17、的距离，计算、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算 各种已知氨基酸和未知氨基酸的各种已知氨基酸和未知氨基酸的R Rf f值值。3 3、分析混合样品中未知氨基酸的组分、分析混合样品中未知氨基酸的组分。2022/12/29242022/12/2925六、思考题：六、思考题：1 1、分析影响分配系数的因素有哪些？、分析影响分配系数的因素有哪些？2 2、何谓分配层析法，分配系数？、何谓分配层析法，分配系数？3 3、茚三酮丙酮溶液的作用机制？茚三酮丙酮溶液的作用机制？七、思考题答案思考题答案l1、答：质量比和pH都有影响。当萃取剂浓度、组成、水相成分以及温度等改变时，分离系数就要发生变化。2022/12/2926七、思考题答案思考题答案l2、答：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同,使之分离。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。指一定温度下，处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。2022/12/2927七、思考题答案思考题答案2022/12/2928l3、氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。