第十二章 荧光分析法.ppt

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1、第十二章第十二章 荧光分析法荧光分析法1n光致发光光致发光物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光还会物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光还会发射发射出出比原来所吸收的波长比原来所吸收的波长更长的光更长的光的现象。的现象。n荧光荧光物质分子接受光子能量被激发后，从物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动激发态的最低振动能级能级返回基态时所返回基态时所发射发射的光。的光。n分子荧光和原子荧光分子荧光和原子荧光2第一节第一节 荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理电子能级的多重性电子能级的多重性 M=2s+1M=1 单重态单重态 M=3 三重态三重态一、分子荧光一、分子荧光（一）分子荧光

2、的产生（一）分子荧光的产生1.1.分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程M=1M=1M=1M=1M=3M=33S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫4u振动驰豫振动驰豫激发态各振动能级的分子通过碰撞释放能量，返回激发态各振动能级的分子通过碰撞释放能量，返回同一电子激发态的最低振动能级的过程。同一电子激发态的最低振动能级的过程。u内部能量转换内部能量转换当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子

3、能级的叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的过程。过程。（振动失活在同样多重态间进行，如（振动失活在同样多重态间进行，如S2*S1*）术术 语语5n外部能量转换外部能量转换激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形式释放能量的过程。式释放能量的过程。n体系间跨越体系间跨越处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程，如多重性发生变化的过程，如S1*T1*术术 语语6n荧光发射荧光发射第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级 基态（任一基态（任一振动能级）振动能级）发射荧光

4、的过程约为发射荧光的过程约为10-910-7sn磷光发射磷光发射激发三重态的最低振动能级激发三重态的最低振动能级 基态（任一振动基态（任一振动能级）能级）发射磷光的过程约为发射磷光的过程约为10-410s或更长或更长磷光法不如荧光法普遍磷光法不如荧光法普遍7分子发光分子发光u荧光、磷光和化学发光统称为荧光、磷光和化学发光统称为分子发光分子发光u荧光和磷光是荧光和磷光是光致发光光致发光u化学发光化学发光是由于分子的外层电子是由于分子的外层电子在化学能的在化学能的作用下作用下使分子处于激发态，再以无辐射驰豫使分子处于激发态，再以无辐射驰豫转入第一电子激发态的最低振动能级，然后转入第一电子激发态的最

5、低振动能级，然后跃回基态的各个振动能级并产生光辐射。跃回基态的各个振动能级并产生光辐射。8（二）荧光的激发光谱和发射光谱（二）荧光的激发光谱和发射光谱n激发光谱（形状与吸收光谱相似）激发光谱（形状与吸收光谱相似）固定某一发射波长，测定该波长下固定某一发射波长，测定该波长下荧光发射强度随激发波长变化所得荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱。的光谱。荧光强度荧光强度激发波长激发波长 n发射光谱（荧光光谱）发射光谱（荧光光谱）固定某一激发波长，测定荧光发射固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化所得的光谱。强度随发射波长变化所得的光谱。荧光强度荧光强度发射波长发射波长萘的激发光谱及荧光和磷光

6、的发射光谱萘的激发光谱及荧光和磷光的发射光谱 9 荧光光谱特征荧光光谱特征苝的苯溶液（苝的苯溶液（a a）和硫酸奎宁的稀硫酸溶液（）和硫酸奎宁的稀硫酸溶液（b b）吸收光谱和荧光发射光谱吸收光谱和荧光发射光谱 10n1.1.斯托克斯位移斯托克斯位移 荧光发射波长总是大于激发波长的现象荧光发射波长总是大于激发波长的现象n2.2.荧光发射光谱与激发波长无关荧光发射光谱与激发波长无关 荧光发射光谱只有一个发射带荧光发射光谱只有一个发射带 第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态各振动能级基态各振动能级n3.3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光光谱与激发光谱的镜像关系 基态与激发态

7、的振动能级间隔类似基态与激发态的振动能级间隔类似 激发光谱：基态激发光谱：基态激发态各振动能级激发态各振动能级 荧光光谱：激发态荧光光谱：激发态基态各振动能级基态各振动能级荧光光谱特征荧光光谱特征11二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构n荧光寿命荧光寿命 除去激发光源后，分子除去激发光源后，分子的荧光强度的荧光强度降低到最大降低到最大荧光强度的荧光强度的1/e所需的时所需的时间，用间，用 f 表示。表示。n以以lnF0/Ft 作图，直线斜作图，直线斜率即为率即为1/f。（一）荧光寿命和荧光效率（一）荧光寿命和荧光效率12荧光效率荧光效率物质的荧光效率在物质的荧光效率在01之间，之间，0.11时

8、有分析价值。时有分析价值。13（二）有机化合物分子结构与荧光的关系（二）有机化合物分子结构与荧光的关系n物质发射荧光的两个条件：物质发射荧光的两个条件：强的紫外吸收、强的紫外吸收、一定的荧光效率一定的荧光效率一般地，大多数荧光物质受到激发后，首先经历一般地，大多数荧光物质受到激发后，首先经历*或或n*跃迁，经过振动驰豫或其它无辐射跃跃迁，经过振动驰豫或其它无辐射跃迁，再发生迁，再发生*或或*n跃迁，产生荧光。跃迁，产生荧光。由于由于*比比n*跃迁的强度更大，寿命更短，跃迁的强度更大，寿命更短，因此因此*常能产生较强的荧光常能产生较强的荧光。虽然虽然n*跃迁产生的荧光较跃迁产生的荧光较*弱，但在

9、发生弱，但在发生n*跃迁时，紧接着产生体系间跨越，最后从跃迁时，紧接着产生体系间跨越，最后从*三三重态回到重态回到 基态，产生更强的磷光。基态，产生更强的磷光。141.长共轭结构长共轭结构n能产生荧光的物质大都含有芳香环或杂环，或是长能产生荧光的物质大都含有芳香环或杂环，或是长共轭双键的脂肪烃共轭双键的脂肪烃n共轭效应增大了荧光物质的摩尔吸收系数，有利于共轭效应增大了荧光物质的摩尔吸收系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的产生产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的产生苯苯 ex 205nm em 278nm 0.11萘萘 ex 286nm em 321nm 0.29蒽蒽 ex 35

10、6nm em 404nm 0.36152.分子的刚性分子的刚性n分子的刚性越强，荧光效率越大分子的刚性越强，荧光效率越大联苯联苯 0.2芴芴 1.0无荧光无荧光有荧光有荧光163.取代基取代基n给电子取代基常使给电子取代基常使荧光强度增大荧光强度增大 如：如：-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等等n吸电子取代基常使吸电子取代基常使荧光强度降低荧光强度降低 如：如：-COOH、-NO、-NO2、-SH、RCO-等等n卤素取代基随卤原子序数的增加而荧光下降卤素取代基随卤原子序数的增加而荧光下降1-氯代萘氯代萘 0.05 1-溴代萘溴代萘 0.002 1-碘代萘碘代萘 0.00

11、0 可能是由可能是由“重原子效应重原子效应”所致。在重原子中，能级之间的所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，容易发生自旋轨道的相互作用，增加交叉现象比较严重，容易发生自旋轨道的相互作用，增加了体系间跨越的速度。了体系间跨越的速度。17（三）荧光试剂（三）荧光试剂n作用：产生强荧光性产物作用：产生强荧光性产物1.荧光胺荧光胺2.邻苯二甲醛邻苯二甲醛3.1-二甲氨基二甲氨基-5-氯化磺酰萘氯化磺酰萘4.测定无机离子的荧光试剂测定无机离子的荧光试剂18三、三、影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素温度升高通常会使荧光效率和荧光强度降低温度升高通常会使荧光效率和荧光强度降低 乙醇乙醇

12、-80 C =1.00温度每增加温度每增加10 C，荧荧光效率减小光效率减小约约3%1.温度温度192.溶剂溶剂n一般地，随极性溶剂的增加，荧光波长长移，一般地，随极性溶剂的增加，荧光波长长移，荧光强度增强。荧光强度增强。奎宁在苯、乙醇和水中的荧光效率的相对大小奎宁在苯、乙醇和水中的荧光效率的相对大小为为1、30、1000。n溶剂粘度减小，分子碰撞机会增加，荧光减弱。溶剂粘度减小，分子碰撞机会增加，荧光减弱。203.酸度酸度n每一种荧光物质都有其最适宜的每一种荧光物质都有其最适宜的pH范围范围21 下列中能使苯胺引起荧光熄灭的是（下列中能使苯胺引起荧光熄灭的是（）A.乙醇乙醇 B.盐酸盐酸 C

13、.水水 D.硫酸硫酸 苯胺在（苯胺在（）条件下荧光强度最强）条件下荧光强度最强A.pH=1 B.pH=3 C.pH=10 D.pH=13C BD 224.荧光熄灭剂荧光熄灭剂n荧光熄灭（荧光猝灭）荧光熄灭（荧光猝灭）荧光强度降低的现象荧光强度降低的现象n荧光熄灭剂荧光熄灭剂 卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等等物、重氮化合物、羰基化合物等等n荧光熄灭原因荧光熄灭原因 分子碰撞失去能量、生成不发光的物质、氧分子碰撞失去能量、生成不发光的物质、氧的熄灭作用、自熄灭和自吸收的熄灭作用、自熄灭和自吸收23n由于氧分子的顺磁性质，溶液

14、中溶解氧的存在，由于氧分子的顺磁性质，溶液中溶解氧的存在，使激发单重态分子向三重态的体系间跨越速率增使激发单重态分子向三重态的体系间跨越速率增加，因而会使荧光效率降低。其它顺磁性物质也加，因而会使荧光效率降低。其它顺磁性物质也有这种作用。有这种作用。碰撞熄灭碰撞熄灭能量转移能量转移氧的熄灭作用氧的熄灭作用245.散射光散射光n散射散射 光子与物质相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向光子与物质相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同的方向散射。不同的方向散射。n瑞利散射瑞利散射 光子和物质分子发生弹性碰撞，只有光子运动方向发光子和物质分子发生弹性碰撞，只有光子运动方向发生改变的散射光，其波长与入

15、射光波长相同。生改变的散射光，其波长与入射光波长相同。n拉曼散射拉曼散射 光子和物质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向发生光子和物质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向发生改变的同时，光子与物质发生能量交换，改变的同时，光子与物质发生能量交换，发射出比入发射出比入射光更长或更短的散射光射光更长或更短的散射光。25波长波长320nm的入射光激发硫酸奎宁的稀硫的入射光激发硫酸奎宁的稀硫酸溶液时，将产生酸溶液时，将产生320nm的（的（）A.荧光荧光 B.磷光磷光 C.瑞利光瑞利光 D.拉曼光拉曼光C如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？26n溶剂中杂质的荧光光谱或溶剂的

16、拉曼光谱可溶剂中杂质的荧光光谱或溶剂的拉曼光谱可能干扰测定。能干扰测定。n溶剂溶剂在不同波长的激发光照射下，其在不同波长的激发光照射下，其拉曼光拉曼光的波长随激发光波长的变化而变化的波长随激发光波长的变化而变化，而，而物质物质的荧光波长不变的荧光波长不变，所以可以，所以可以通过选择适当的通过选择适当的激发波长来消除拉曼光的干扰。激发波长来消除拉曼光的干扰。27 荧光法测定硫酸奎宁时，激发光波长若选择在荧光法测定硫酸奎宁时，激发光波长若选择在320nm320nm，拉曼光波长为，拉曼光波长为360nm360nm；若激发光波长选择；若激发光波长选择在在350nm350nm，拉曼光波长为，拉曼光波长为

17、400nm400nm。荧光波长为。荧光波长为448nm448nm。则测定时选择波长应为。则测定时选择波长应为（）A.ex320nm em 400nm B.ex320nm em 360nmC.ex350nm em 448nm D.ex320nm em 448nmD28第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系低浓度时呈现良好的线形关系低浓度时呈现良好的线形关系29n对于荧光法对于荧光法 F=2.3k I0EClF I0，I0 增强，增强，F增大；低浓度时，增大；低浓度时，F C只要检测器灵敏，可检测微弱信号。只要检测器灵敏，可检测微弱信

18、号。n对于分光光度法对于分光光度法 A=-lgT=EClC极小时，极小时，A0，无吸收；，无吸收；若若C不变，改变入射光不变，改变入射光I0强度，强度，A无变化。无变化。所以吸收光谱受一定限制，灵敏度小于荧光光谱。所以吸收光谱受一定限制，灵敏度小于荧光光谱。为什么荧光分析法比紫外可见法更灵敏？为什么荧光分析法比紫外可见法更灵敏？30二、定量分析方法二、定量分析方法n1.校正曲线法校正曲线法 FCn2.比例法比例法（空白不能调零时，要扣（空白不能调零时，要扣除空白）除空白）n3.联立方程式法联立方程式法31第三节第三节 荧光分光光度计和分析新技术荧光分光光度计和分析新技术滤光片荧光计滤光片荧光计

19、滤光片单色器荧光计滤光片单色器荧光计荧光分光光度计荧光分光光度计32荧光分光光度计结构示意图荧光分光光度计结构示意图1.光源光源 2、4、7、9.狭缝狭缝 3.激发单色器激发单色器 5.样品池样品池 6.表面吸光物质表面吸光物质 8.发射单色器发射单色器 10.检测器检测器 11.放大器放大器 12.指示器指示器 13.记录器记录器源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统一、荧光分光光度计一、荧光分光光度计1.1.主要部件主要部件33在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角的方在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角的

20、方向上进行测量，这是由于（向上进行测量，这是由于（）A.只有在入射光线成直角的方向上才有荧光只有在入射光线成直角的方向上才有荧光B.荧光强度比透射光强度小荧光强度比透射光强度小C.荧光强度比透射光强度大荧光强度比透射光强度大D.荧光波长比透射光波长长荧光波长比透射光波长长E.荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光的影响荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光的影响荧光分光光度计常使用的光源是（荧光分光光度计常使用的光源是（）A.空心阴极灯空心阴极灯 B.氙灯氙灯 C.氢灯氢灯 D.硅碳棒硅碳棒BE342.仪器的校正仪器的校正（1）灵敏度的校正）灵敏度的校正 一定浓度的稳定荧光物质作对照品溶液调仪

21、器一定浓度的稳定荧光物质作对照品溶液调仪器（如（如1ug/ml硫酸奎宁）硫酸奎宁）（2）波长校正）波长校正 汞灯的标准谱线汞灯的标准谱线（3）激发光谱和荧光光谱的校正）激发光谱和荧光光谱的校正 光源强度、检测器的感应度光源强度、检测器的感应度353.荧光分析法的应用荧光分析法的应用（1）无机化合物的分析）无机化合物的分析n采用有机试剂进行荧光分析的元素已近采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70多种多种n能够与金属离子形成荧光络合物的能够与金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数有机试剂绝大多数是芳香族化合物是芳香族化合物。（分子刚性平面结构增大）。（分子刚性平面结构增大）n另一类络合物是三元离

22、子缔合物。另一类络合物是三元离子缔合物。例：罗丹明例：罗丹明B为阳离子荧光染料，为阳离子荧光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等等阳离子首先与卤素离子形成二元络阴离子，再与罗丹阳离子首先与卤素离子形成二元络阴离子，再与罗丹明明B缔合形成荧光化合物。缔合形成荧光化合物。n荧光猝灭法荧光猝灭法也是常采用的方法。也是常采用的方法。36（2）有机化合物的分析）有机化合物的分析n脂肪族有机化合物本身能发荧光的很少，需要与某脂肪族有机化合物本身能发荧光的很少，需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析些试剂反应后才能进行荧光分析n芳香族化合物芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发因具有共轭的不饱和体系，多

23、数能发生荧光，可直接用荧光法测定。对具有致癌活性的生荧光，可直接用荧光法测定。对具有致癌活性的多环芳烃，荧光分析法已成为最主要的测定方法。多环芳烃，荧光分析法已成为最主要的测定方法。n在生物化学分析、生理医学研究和临床、药物分析在生物化学分析、生理医学研究和临床、药物分析领域，许多重要的分析对象，如领域，许多重要的分析对象，如维生素、氨基酸和维生素、氨基酸和蛋白质、胺类、甾族化合物、酶和辅酶蛋白质、胺类、甾族化合物、酶和辅酶等，均可用等，均可用荧光法分析。荧光法分析。37二、荧光分析新技术简介二、荧光分析新技术简介1.激光荧光分析激光荧光分析激光作光源；超低浓度分析激光作光源；超低浓度分析2.

24、时间分辩荧光分析时间分辩荧光分析利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同来实现分别检测。测之间延缓的时间不同来实现分别检测。3.同步荧光分析同步荧光分析4.胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析38（1）关于荧光光谱和激发光谱，叙述错误的是（）关于荧光光谱和激发光谱，叙述错误的是（）A.荧光光谱的形状与激发光的波长无关荧光光谱的形状与激发光的波长无关B.荧光光谱和激发光谱一般是对称镜像关系荧光光谱和激发光谱一般是对称镜像关系C.荧光光谱是分子的吸收光谱荧光光谱是分子的吸收光谱D.荧光激发光谱和紫外吸收光谱的形状相似荧光激发光谱和紫外吸收光谱的形

25、状相似（2）溶液温度降低通常会使荧光效率）溶液温度降低通常会使荧光效率 。（3）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度 。（4）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（）A.苯苯 B.联苯联苯 C.萘萘 D.芴芴 E.蒽蒽（5）下列说法中正确的是（）下列说法中正确的是（）A.长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。B.分子的刚性越强，荧光强度越小。分子的刚性越强，荧光强度越小。C.给电子取代基可导致荧光增强。给电子取代基可导致荧光增强。D.吸电子取代基可导致荧光增强。吸电子取代基可导致荧光增强。39