外周血白细胞中DNA提取与检测.ppt

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1、1试验一试验一 外周血白细胞中外周血白细胞中DNADNA的提取与检测的提取与检测21.掌握真核细胞中掌握真核细胞中DNADNA制备原理。制备原理。2.2.熟悉从外周血白细胞中提取熟悉从外周血白细胞中提取DNADNA的方法。的方法。3.3.掌握紫外分析仪检测掌握紫外分析仪检测DNADNA的原理。的原理。3 破碎细胞破碎细胞 DNADNA提取提取 检测检测STMTSTMT破碎红细胞及白细胞的细胞膜破碎红细胞及白细胞的细胞膜离心收离心收集白细胞核集白细胞核SDSSDS破膜破膜苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀洗涤苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀洗涤琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪检测琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪检测41 1、主要

2、器具、主要器具Eppendorf离心管离心管电泳槽与电泳仪电泳槽与电泳仪紫外分析仪紫外分析仪台式离心机台式离心机微量移液器微量移液器52 2、主要试剂、主要试剂STMTSTMT：（蔗糖、：（蔗糖、Tris-HClTris-HCl、MgClMgCl2 2、TritonX-100TritonX-100）NENE：（NaClNaCl、EDTA NaEDTA Na2 2）TETE：（Tris-HCl、EDTA Na2）SDSSDS苯酚苯酚氯仿氯仿乙醇：无水乙醇、乙醇：无水乙醇、70%70%乙醇乙醇6吸去血清，混匀含有吸去血清，混匀含有EDTA NaEDTA Na2 2的抗凝的抗凝全血全血取取0.3mL

3、0.3mL至至EPEP管管（1 1）加加1mLSTMT1mLSTMT，混匀，混匀离心（离心（12000rpm 1-2min12000rpm 1-2min），），弃上清弃上清加加1mL0.9%1mL0.9%NaNaClCl洗涤洗涤离心离心,弃上清弃上清（12000 12000 rpm 1-2minrpm 1-2min）加加460 460 L NE,充分吹散沉淀充分吹散沉淀加加35 35 L 10%SDS，轻轻混匀，轻轻混匀。1、破碎细胞：、破碎细胞：2 2、DNADNA提取：提取：加等体积苯酚，轻摇加等体积苯酚，轻摇1min1min离心（离心（12000rpm 3-5min12000rpm 3-

4、5min）吸取上层水相于吸取上层水相于另一另一EPEP管管（2 2）加加1/21/2体积苯酚体积苯酚+1/2+1/2体积氯仿体积氯仿-异戊醇，轻摇异戊醇，轻摇1min1min 离心（离心（12000rpm 1min12000rpm 1min）取上取上层水相于层水相于另一另一EPEP管管（3 3）加等体积氯仿加等体积氯仿-异戊醇异戊醇离心（离心（12000rpm 1min12000rpm 1min）取上层取上层水相于水相于另一另一EPEP管管（4 4）3 3、沉淀、沉淀DNADNA加加1/101/10体积体积3M 3M NaACNaAC，混匀，混匀加加1mL1mL无水冰乙醇无水冰乙醇置置-20-

5、20冰箱，冰箱，0.5-1h 0.5-1h 离心离心（12000rpm 5min12000rpm 5min）弃上清弃上清加加70%70%冷乙醇冷乙醇1mL1mL洗涤洗涤离心（离心（12000rpm 5min12000rpm 5min）弃上清弃上清自然干燥自然干燥加加5050 L TE L TE溶解，室温溶解，室温1h1h。74 4、电泳、电泳制胶：制胶：0.8%0.8%的琼脂糖凝胶（琼脂糖的琼脂糖凝胶（琼脂糖0.32g+TBE40ml0.32g+TBE40ml，混合，加热熔化，混合，加热熔化，冷至冷至6060，加，加EB20 EB20 L,L,制胶）制胶）加样：加样：DNADNA样品样品10

6、10 L+L+载样缓冲液载样缓冲液2 2 L L，混匀，取，混匀，取10 10 L点样点样 电泳：点样端接负极，电泳：点样端接负极，100V100V，40min40min紫外分析仪下观察结果紫外分析仪下观察结果8电泳结果图电泳结果图91 1、注意安全（苯酚具有强腐蚀性），操作戴手套；、注意安全（苯酚具有强腐蚀性），操作戴手套；2 2、所用玻璃器皿及溶液需经高压灭菌处理；、所用玻璃器皿及溶液需经高压灭菌处理；3 3、混匀试剂、吸取上清等操作时应动作要轻柔、混匀试剂、吸取上清等操作时应动作要轻柔,避免动作剧烈；避免动作剧烈；4 4、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时 注意不要吸取到中间层及有机相；注意不要吸取到中间层及有机相；5 5、沉淀后注意不要将、沉淀后注意不要将DNADNA沉淀倒掉。沉淀倒掉。10谢谢谢谢各各位位