2发酵液的预处理.ppt
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1、2.2.发酵液的预处理发酵液的预处理23发酵液预处理的内容发酵液预处理的内容固液分离固液分离发酵液发酵液胞外胞外上清液上清液/滤液滤液预处理预处理生化分离的第一步,提取生化物质的第生化分离的第一步,提取生化物质的第一步,分两部分:一步,分两部分:胞内胞内富集细胞富集细胞4n发酵液成分很复杂,包含菌(细胞)体,胞内发酵液成分很复杂,包含菌(细胞)体,胞内外代谢产物,及剩余的培养基残分等。外代谢产物,及剩余的培养基残分等。n不管人们所需要的产物是胞内还是胞外,都首不管人们所需要的产物是胞内还是胞外,都首先要进行培养液的预处理和固液分离开,才能先要进行培养液的预处理和固液分离开,才能进行后续操作进行
2、后续操作n对于胞外产物,可先将菌体或其他悬浮杂质去对于胞外产物,可先将菌体或其他悬浮杂质去除,才能从澄清的滤液中提取代谢产物。除,才能从澄清的滤液中提取代谢产物。n对于胞内产物,首先富集菌体,再进行细胞破对于胞内产物,首先富集菌体,再进行细胞破碎和碎片分离,然后提取胞内产物。碎和碎片分离,然后提取胞内产物。目的目的促进从悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离的效率促进从悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离的效率:改变发酵液的物理性质,包括增大悬浮液中固体粒子的尺改变发酵液的物理性质,包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸,降低液体黏度。寸,降低液体黏度。相对纯化,去除发酵液中的部分杂质(高价无机离子
3、和杂相对纯化,去除发酵液中的部分杂质(高价无机离子和杂蛋白质),以利于后续各步操作。蛋白质),以利于后续各步操作。尽可能使产物转入便于后处理的一相中(多数是液相)尽可能使产物转入便于后处理的一相中(多数是液相);采用絮凝或凝聚的方法,设法增大悬浮液中固体粒子采用絮凝或凝聚的方法,设法增大悬浮液中固体粒子的大小,提高其沉降速度;的大小,提高其沉降速度;或采用稀释、加热等方法降低黏度,以利于过滤。或采用稀释、加热等方法降低黏度,以利于过滤。2.1 2.1 发酵液的预处理发酵液的预处理2.1.1 发酵液过滤特性的改变发酵液过滤特性的改变微生物发酵液的特性为:微生物发酵液的特性为:发酵产物浓度较低,大
4、多为发酵产物浓度较低,大多为1-10%1-10%,悬浮液中大部分是水;,悬浮液中大部分是水;悬浮物颗粒小,相对密度不大;悬浮物颗粒小,相对密度不大;固体粒子可压缩性大;固体粒子可压缩性大;液相粘度大;液相粘度大;性质不稳定,如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用性质不稳定,如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。的影响。微生物发酵液的成分极为复杂,其中除了所培养的微生物菌体及残微生物发酵液的成分极为复杂,其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外,还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋存的固体培养基外,还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质,以及微生物的各种代谢产
5、物。白质,以及微生物的各种代谢产物。2.1.2 2.1.2 预处理的方法预处理的方法1.1.加热法加热法 HeatingHeating2.2.调节悬浮液的调节悬浮液的PHPH值值 Regulation of PHRegulation of PH3.3.助滤剂助滤剂Filter aidsFilter aids和反应剂和反应剂 ReactantReactant4.4.凝聚和絮凝凝聚和絮凝 Coagulation and flocculation Coagulation and flocculation 5.5.杂蛋白的去除杂蛋白的去除 Removal of useless Removal of u
6、seless proteinprotein1.1.加热加热1 1)加热降低液体粘度)加热降低液体粘度 液体黏度是温度的指数函数,液体黏度是温度的指数函数,升温是降低黏度的有效措施。升温是降低黏度的有效措施。可有效提高过滤速率可有效提高过滤速率。加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。加加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。加热能改善发酵液的操作特性。热能改善发酵液的操作特性。麦芽汁的黏度麦芽汁的黏度-温度曲线。温度曲线。n2 2)加热使蛋白质变性凝固)加热使蛋白质变性凝固 变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加热至热至8080以上,可使蛋白质变性凝固,过滤以
7、上,可使蛋白质变性凝固,过滤速度加快。速度加快。2.2.调整调整pHpH1)pH1)pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质,适当值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质,适当调节调节pHpH值可改善其过滤特性值可改善其过滤特性.2)2)调节发酵液的调节发酵液的pHpH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。大幅度改变大幅度改变pHpH还能使蛋白质变性凝固。还能使蛋白质变性凝固。3)3)细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pHpH值下也可能趋于值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒,有利于过滤的进行。絮凝而成为较
8、大颗粒,有利于过滤的进行。0020040060061218pH4.6pH4.2pH3.8pH2.8FiltrateVolume,cm3Time,minutesFigTheeffectonfiltratevolumeofpH3.3.凝聚与絮凝凝聚与絮凝n凝聚与絮凝凝聚与絮凝处处理就是将理就是将某些化学某些化学药剂药剂预预先投先投加到加到悬悬浮液中,改浮液中,改变细变细胞、菌体和蛋白胞、菌体和蛋白质质等等胶体粒子的分散状胶体粒子的分散状态态,破坏其,破坏其稳稳定性,使其定性,使其聚集聚集起来起来,增大体增大体积积以便固液分离。以便固液分离。n凝聚和絮凝技凝聚和絮凝技术术常用于菌体常用于菌体细细小而
9、且黏度大小而且黏度大的的发发酵液的酵液的预处预处理中。理中。机理:机理:1)中和粒子表面电荷中和粒子表面电荷,消除双电层结构消除双电层结构2 2)破坏水化膜)破坏水化膜(1 1)凝聚)凝聚 指在投加的化学物质(铝、铁的化合物)作用下,使粒子相指在投加的化学物质(铝、铁的化合物)作用下,使粒子相互聚集成互聚集成 mm mm 大小块状凝聚体的过程。大小块状凝聚体的过程。n发酵液中菌体表面发酵液中菌体表面带有负电荷,由于带有负电荷,由于静电引力使溶液中静电引力使溶液中反离子被吸附在其反离子被吸附在其周围,在界面上形周围,在界面上形成了双电层。成了双电层。胶体双电层结构胶体双电层结构阳离子对带负电荷的
10、胶粒凝聚能力的次序为:阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为:Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+常用的凝聚剂电解质有:常用的凝聚剂电解质有:硫酸铝硫酸铝 AlAl2 2(SO(SO4 4)3 3 18H18H2 2O O(明矾);(明矾);氯化铝氯化铝 AlClAlCl3 3 6H6H2 2O;O;三氯化铁三氯化铁 FeClFeCl3 3;硫酸亚铁硫酸亚铁 FeSOFeSO4 47H7H2 2O O;石灰;石灰;ZnSOZnSO4 4;MgCOMgCO3 3(2)絮凝)絮凝l指使用絮凝剂(天然的和合成的大分子量聚电解质)将胶体粒指使用絮凝剂(天然的和合成的大分子量聚电解质)将
11、胶体粒子相互连接,形成子相互连接,形成10mm大小絮凝团的过程。大小絮凝团的过程。l絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物,长链状结构,其链节,长链状结构,其链节上含有许多活性官能团,包括带电荷的阴离子(如上含有许多活性官能团,包括带电荷的阴离子(如-COOH)或)或阳离子(如阳离子(如-NH2)基团以及不带电荷的非离子型基团。)基团以及不带电荷的非离子型基团。l絮凝剂通过静电引力、范德华引力或氢键的作用,强烈地吸附絮凝剂通过静电引力、范德华引力或氢键的作用,强烈地吸附在胶粒的表面。在胶粒的表面。18高分子絮凝剂的吸附架桥作用高分子絮凝剂的吸附架桥作用 絮凝剂的类
12、型:絮凝剂的类型:工业上使用的絮凝剂可分为四类:工业上使用的絮凝剂可分为四类:人工合成有机高分子聚合物人工合成有机高分子聚合物天然有机高分子聚合物天然有机高分子聚合物无机高分子聚合物,微生物絮凝剂无机高分子聚合物,微生物絮凝剂1 1)人工合成有机高分子聚合物:)人工合成有机高分子聚合物:目前常用的是人工合成有机高分子聚合物,如聚目前常用的是人工合成有机高分子聚合物,如聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物;丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物;聚丙烯聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物。酸类和聚苯乙烯类衍生物。高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同,高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不
13、同,可分为三类:阴离子型(含有羧基可分为三类:阴离子型(含有羧基)阳离子型(含有胺基)阳离子型(含有胺基)、非离子型、非离子型2 2)天然有机高分子絮凝剂)天然有机高分子絮凝剂 人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快,但还人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快,但还存在着有毒,生物降解难等问题,所以其应用受到存在着有毒,生物降解难等问题,所以其应用受到了限制。了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒,易生物降解,天然有机高分子絮凝剂具有无毒,易生物降解,原料来源广等优点。原料来源广等优点。n天然有机高分子絮凝剂根据其原料来源不同可分天然有机高分子絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类
14、和聚多糖类。为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。n其中淀粉絮凝剂的研究开发最引人注目。其中淀粉絮凝剂的研究开发最引人注目。3 3)无机高分子聚合物)无机高分子聚合物聚合铁系和铝系两大类聚合铁系和铝系两大类u聚合铁絮凝剂具有操作简单、费用低,受温度影聚合铁絮凝剂具有操作简单、费用低,受温度影响小,亲和力强,能有效地去除悬浮物等优点,响小,亲和力强,能有效地去除悬浮物等优点,缺点腐蚀性强、稳定性差。缺点腐蚀性强、稳定性差。u聚合铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机聚合铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机金属盐絮凝剂,絮凝效果好,缺点具毒性等。金属盐絮凝剂,絮凝效果好,缺点具毒性等。4 4)
15、微生物絮凝剂)微生物絮凝剂n微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂,微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂,n由由微生物微生物或其分泌物产生的具有絮凝功能的代谢产或其分泌物产生的具有絮凝功能的代谢产物。物。n包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂,克隆技术所获得的絮凝剂胞壁代谢产物的絮凝剂,克隆技术所获得的絮凝剂 n主要成分是糖蛋白、多糖、纤维素及核酸等高分子主要成分是糖蛋白、多糖、纤维素及核酸等高分子物质。物质。n微生物絮凝剂和天然絮凝剂(与化学合成的絮凝剂微生物絮凝剂和天然絮凝剂(与化学合成的絮凝剂相比)最大的优
16、点是安全,无毒和不污染环境相比)最大的优点是安全,无毒和不污染环境。n常用微生物絮凝剂常用微生物絮凝剂:红平红球菌,浮游藻类,分枝:红平红球菌,浮游藻类,分枝杆菌,硅酸盐芽孢杆菌。杆菌,硅酸盐芽孢杆菌。絮凝的影响因素絮凝的影响因素n发发酵液的性酵液的性质质(细细胞胞浓浓度,表面度,表面电电荷);荷);n絮凝絮凝剂剂的的浓浓度:絮凝效度:絮凝效果呈果呈钟钟形形变变化。化。npH pH 控制;控制;pHpH主要影响离主要影响离子型絮凝子型絮凝剂剂功能功能团团的的电电离度,从而影响了分子离度,从而影响了分子链链的伸展状的伸展状态态,改,改变变了了絮凝作用絮凝作用n搅搅拌速度拌速度4 4.加入助滤剂(
17、加入助滤剂(filter aidsfilter aids)n一种不可压缩的多孔微粒,一种不可压缩的多孔微粒,n在发酵液中加入助滤剂,在发酵液中加入助滤剂,菌体可吸附在助滤剂上,菌体可吸附在助滤剂上,降低了过滤阻力。降低了过滤阻力。n目前生物工业中常用的助目前生物工业中常用的助滤剂是活性炭、石英砂、滤剂是活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、硅藻土,石棉粉、纤维素、硅藻土,珍珠岩粉等。珍珠岩粉等。加入某些不影响目标产物的反应剂,可消除发酵液中的一些加入某些不影响目标产物的反应剂,可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响,从而提高过滤速度。杂质对过滤的影响,从而提高过滤速度。u1 1)加入反应剂与某些可溶性
18、盐类发生反应生成不溶性沉淀)加入反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,生生成的沉淀能防止菌丝体粘结,使菌丝具有块状结构,又能使蛋成的沉淀能防止菌丝体粘结,使菌丝具有块状结构,又能使蛋白质凝固,过滤性能上升,沉淀本身可作为助滤剂白质凝固,过滤性能上升,沉淀本身可作为助滤剂.如在新生如在新生霉素发酵液中加入霉素发酵液中加入CaClCaCl2 2和和NaNa3 3POPO4 4,生成,生成CaCa3 3(PO4)(PO4)2 2沉淀。沉淀。u2 2)发酵液中含有不溶性多糖物质时,用)发酵液中含有不溶性多糖物质时,用酶酶将其转化为单糖,将其转化为单糖,以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基,
19、发酵液过滤前以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基,发酵液过滤前加入加入0.025%0.025%的淀粉酶,搅拌的淀粉酶,搅拌30min30min后,再加后,再加2.5%2.5%硅藻土助滤剂,硅藻土助滤剂,可提高过滤效率可提高过滤效率5 5倍。倍。5.5.加入反应剂加入反应剂 发酵液中的杂质发酵液中的杂质a.高价无机离子(高价无机离子(Ca2+、Mg2+、Fe2+)b.杂蛋白杂蛋白在采用离子交换提炼时,会影响树脂对生化物质的交换容量。在采用离子交换提炼时,会影响树脂对生化物质的交换容量。u在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力,在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附
20、能力,u在常规过滤或膜过滤时,易使过滤介质堵塞或受污染,影响过滤效率。在常规过滤或膜过滤时,易使过滤介质堵塞或受污染,影响过滤效率。因此,在预处理时,应尽量除去这些物质。因此,在预处理时,应尽量除去这些物质。2.1.3 2.1.3 发酵液的相对纯化发酵液的相对纯化除去发酵液中一些杂蛋白或高价无机离子除去发酵液中一些杂蛋白或高价无机离子1.1.高价无机离子的去除方法高价无机离子的去除方法1)Ca1)Ca2+2+草酸、草酸钠,草酸、草酸钠,形成草酸钙沉淀形成草酸钙沉淀(注意回收草酸)(注意回收草酸);2)Mg2)Mg2+2+三聚磷酸钠,三聚磷酸钠,形成三聚磷酸钠镁可形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物;溶
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