第二章+天然产物的提取分离.ppt

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1、第二章第二章天然产物的提取分离鉴定天然产物的提取分离鉴定 一、基本概念一、基本概念1、提提取取：利利用用适适当当的的溶溶剂剂或或方方法法，将将所所要成分尽可能从原料中完全提出的过程。要成分尽可能从原料中完全提出的过程。2、分分离离：将将提提取取物物中中所所含含的的各各种种成成分分一一一一分分开开，并并将将得得到到的的单单体体加加以以精精制制的的过过程。程。第一节第一节天然产物的提取天然产物的提取水水亲水性有机溶剂亲水性有机溶剂亲脂性有机溶剂亲脂性有机溶剂二、提取方法二、提取方法l超临界流体萃取法（超临界流体萃取法（SFE）l水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法l溶剂提取法溶剂提取法l升华法升华法l压榨法压

2、榨法溶剂溶剂（一）溶剂提取法一）溶剂提取法根根据据天天然然成成分分的的溶溶解解性性不不同同，选选用用对对所所需需成成分分溶溶解解度度大大而而对对其其他他成成分分溶溶解解度度小小的的溶溶剂剂，将将所所需需成成分分从从生生物物材材料料中中溶溶解解出出来的一种提取方法。来的一种提取方法。溶剂提取是指溶剂进入生物体细胞，溶剂提取是指溶剂进入生物体细胞，溶解或分散其有用物质而变成浸出物的全溶解或分散其有用物质而变成浸出物的全过程。过程。包括浸润、解吸和扩散三个阶段。包括浸润、解吸和扩散三个阶段。1、溶剂提取法的原理、溶剂提取法的原理选择溶剂依据相似相溶原理。选择溶剂依据相似相溶原理。浸润：渗透阶段浸润：

3、渗透阶段 溶剂通过细胞壁渗透到细胞中。溶剂通过细胞壁渗透到细胞中。解吸：溶解阶段解吸：溶解阶段 细胞内容物与细胞组织之间有亲和细胞内容物与细胞组织之间有亲和 力，溶剂破除这种亲和力。力，溶剂破除这种亲和力。扩散：置换阶段扩散：置换阶段 利用细胞内的渗透力产生的压差而抽利用细胞内的渗透力产生的压差而抽提出来，用溶剂占领内容物的位置而将内提出来，用溶剂占领内容物的位置而将内容物置换出来。容物置换出来。扩散过程表达式：扩散过程表达式：dt:扩散时间扩散时间F：扩散面积，以粉碎度表示：扩散面积，以粉碎度表示浓度差浓度差D：扩散系数扩散系数ds:在在dt时间内的扩散量时间内的扩散量2、选择溶剂的要点、选

4、择溶剂的要点*对所要成分溶解度大对所要成分溶解度大*沸点适中容易回收沸点适中容易回收*低毒安全低毒安全*廉价廉价天然产物成分中，萜、甾等大环、稠环化天然产物成分中，萜、甾等大环、稠环化合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因存在状态不同溶解性不同。存在状态不同溶解性不同。最常用的溶剂为乙醇。最常用的溶剂为乙醇。3、溶剂的分类、溶剂的分类*强极性溶剂：水强极性溶剂：水*亲水性有机溶剂：亲水性有机溶剂：能与水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）能与水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*亲脂性有

5、机溶剂：亲脂性有机溶剂：不不与与水水任任意意混混溶溶，可可分分层层（正正丁丁醇醇、乙乙醚醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、环己烷、石油醚）乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、环己烷、石油醚）常用溶剂的极性大小顺序：常用溶剂的极性大小顺序：石石油油醚醚四四氯氯化化碳碳苯苯氯氯仿仿乙乙醚醚乙乙酸酸乙乙酯酯正丁醇正丁醇丙酮丙酮乙醇（甲醇）乙醇（甲醇）Kb K=CU/CL CU、CL为被分离物质在上相和下相中浓度为被分离物质在上相和下相中浓度 2、两相溶剂萃取法、两相溶剂萃取法利用混和物中各成分在两种互不相溶的溶剂利用混和物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的方法。中分配系数不同而达到分离的方法。

6、根据根据值的大小可决定分离采用的方法值的大小可决定分离采用的方法 100,简单的一次萃取，可基本分离。简单的一次萃取，可基本分离。10，数次乃至，数次乃至10余次萃取，余次萃取，CCD法法2，100次以上萃取，次以上萃取，DCCC法，法，HSCCC法法1，不能分离，不能分离可以根据可以根据PC法计算法计算值，选择理想的分离条件。值，选择理想的分离条件。纸色谱（纸色谱（PC），也叫纸分配色谱（），也叫纸分配色谱（PPC，Paper Partition Chromatography）(为纸色谱定数为纸色谱定数)Rfa、Rfb为为A、B两物质在两物质在PC上的上的Rf值值 pH值值 对于酸性、碱性和

7、两性化合物，对于酸性、碱性和两性化合物，pH值可以改值可以改变它们的存在状态（游离型、解离型），分配比变它们的存在状态（游离型、解离型），分配比受受pH的影响。的影响。HA+H2O=A-+H3O+pKa=pH -logA-/HApH =pKa+logA-/HAHA达到达到99%解离时，解离时，pH=pKa+2HA达到达到99%游离时，游离时，pH=pKa -2 2)酸碱性成分的分离酸碱性成分的分离-pH梯度萃取法梯度萃取法 按酸碱性强弱的不同分离酸性、碱性、中按酸碱性强弱的不同分离酸性、碱性、中性物质，改变性物质，改变pH值使酸碱成分呈不同状态。值使酸碱成分呈不同状态。如中药大黄中的大黄酸、大

8、黄素和大黄酚的分离如中药大黄中的大黄酸、大黄素和大黄酚的分离 大黄酸大黄酸大黄素大黄素大黄酚大黄酚酸性最强酸性最强酸性其次酸性其次酸性最弱酸性最弱溶于溶于NaHCO3溶于溶于Na2CO3溶于溶于NaOH 3)几种逆流分配方法几种逆流分配方法 逆流分溶法逆流分溶法液滴逆流色谱液滴逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱 逆流分溶法（逆流分溶法（CCD法）法）多次连续液多次连续液-液萃取分离过程液萃取分离过程特点：条件温和，样品易回收，适用于中等极性、特点：条件温和，样品易回收，适用于中等极性、不稳定物质的分离。不稳定物质的分离。实验室萃取设备：实验室萃取设备：1、分液漏斗、分液漏斗 2、克雷克雷格逆流分

9、布仪格逆流分布仪。克雷格逆流分布仪克雷格逆流分布仪 把一系列的分液漏斗有效地排成链，重复进把一系列的分液漏斗有效地排成链，重复进行系列的步骤：振摇（混合）、静置、分离，多行系列的步骤：振摇（混合）、静置、分离，多次重复，以提高分离的塔板数。次重复，以提高分离的塔板数。液滴逆流色谱（液滴逆流色谱（DCCC）液液分配色谱，流动相呈液滴形式垂直上升或液液分配色谱，流动相呈液滴形式垂直上升或下降，通过固定相，实现物质的逆流色谱分配。下降，通过固定相，实现物质的逆流色谱分配。特点：不易乳化，样品可定量回收，分离效果好，特点：不易乳化，样品可定量回收，分离效果好，特别适合于分离皂苷等水溶性成分。特别适合于

10、分离皂苷等水溶性成分。缺点：样品处理量小。缺点：样品处理量小。液滴逆流色谱液滴逆流色谱 高速逆流色谱（高速逆流色谱（HSCCC）通过特定的高速行星式旋转所产生的离心力通过特定的高速行星式旋转所产生的离心力场作用，使无载体支持的液体固定相稳定地保留场作用，使无载体支持的液体固定相稳定地保留在蛇形管内，并使流动相单向、低速通过固定相，在蛇形管内，并使流动相单向、低速通过固定相，实现连续逆流萃取分离物质的目的。实现连续逆流萃取分离物质的目的。用于各种物质的分离，包括蛋白质、酶、三用于各种物质的分离，包括蛋白质、酶、三萜、生物碱、皂苷等。萜、生物碱、皂苷等。4)液液-液分配柱色谱液分配柱色谱 正向色谱

11、正向色谱 固定相极性大，如水、缓冲液等；固定相极性大，如水、缓冲液等；流动相极性小，如氯仿、乙酸乙酯等流动相极性小，如氯仿、乙酸乙酯等载体：硅胶（含水一般大于载体：硅胶（含水一般大于17%），硅藻土、纤维素等。），硅藻土、纤维素等。分离极性较大或水溶性成分，如苷类、糖、生物碱等。分离极性较大或水溶性成分，如苷类、糖、生物碱等。洗脱顺序：极性小的物质先被洗脱出来。洗脱顺序：极性小的物质先被洗脱出来。4)液液-液分配柱色谱液分配柱色谱 固定相极性小于流动相固定相极性小于流动相，如，如HPLC反相色谱柱、反相薄层反相色谱柱、反相薄层色谱板。色谱板。固定相固定相：硅胶的硅醇基与烷基结合，如：硅胶的硅醇

12、基与烷基结合，如RP-2、RP-8、RP-18，亲脂性亲脂性：RP-18 RP-8 RP-2流动相流动相（洗脱剂）：（洗脱剂）：MeOH-H2O；CH3CN-H2O洗脱顺序洗脱顺序：分离极性大的成分：分离极性大的成分，极性大者先被洗脱出来，极性大者先被洗脱出来。反相色谱：反相色谱：固定相的表面修饰固定相的表面修饰 三、根据物质的吸附性差别进行分离三、根据物质的吸附性差别进行分离-吸吸附色谱法附色谱法 1、吸附分类、吸附分类 物理吸附：物理吸附：无选择性吸附，吸附无选择性吸附，吸附-解吸附发生迅速，吸附解吸附发生迅速，吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭等；剂如硅胶、氧化铝、活性炭等；化学吸附：化学吸附

13、：不可逆吸附，如碱性氧化铝对酚酸性成分的不可逆吸附，如碱性氧化铝对酚酸性成分的吸附；酸性硅胶对生物碱的吸附等；吸附；酸性硅胶对生物碱的吸附等；半化学吸附：半化学吸附：聚酰胺对酚酸类、醌类的氢键吸附。聚酰胺对酚酸类、醌类的氢键吸附。吸附原理：相似相吸吸附原理：相似相吸 影响吸附过程的三要素：影响吸附过程的三要素：吸附剂（固定相）吸附剂（固定相）溶质（被分离物质）溶质（被分离物质）溶剂（洗脱剂、展开剂、流动相）溶剂（洗脱剂、展开剂、流动相）2、硅胶、氧化铝、硅胶、氧化铝 极性吸附剂极性吸附剂：载样量大，吸附力强：载样量大，吸附力强硅胶硅胶：有中性、酸性之分，适用于各类成分分离。：有中性、酸性之分，

14、适用于各类成分分离。氧化铝：有中性、酸性、碱性之分，不适合于分离氧化铝：有中性、酸性、碱性之分，不适合于分离酸性成分，多用于分离生物碱。酸性成分，多用于分离生物碱。2、硅胶、氧化铝、硅胶、氧化铝 被分离物质吸附力与结构的关系被分离物质吸附力与结构的关系 被分离物质极性大，吸附力强，难洗脱，被分离物质极性大，吸附力强，难洗脱，Rf值小。值小。官能团极性大小排列顺序：官能团极性大小排列顺序：-COOH Ar-OH R-OH R-NH2、RNHR、RNRR RCONRR RCHO RCOR RCOOR ROR RH 2、硅胶、氧化铝、硅胶、氧化铝 溶剂（洗脱剂）的极性与洗脱力的关系溶剂（洗脱剂）的极

15、性与洗脱力的关系洗脱剂极性越大，洗脱力越强；洗脱剂极性越大，洗脱力越强；例：从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷例：从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷成分，根据极性大小推测从硅胶柱上的洗脱成分，根据极性大小推测从硅胶柱上的洗脱顺序。顺序。名称名称RR黄黄夹夹苷苷ACHO(D-glc)2黄黄夹夹苷苷BCH3(D-glc)2黄黄夹夹次苷次苷ACHOH黄黄夹夹次苷次苷BCH3H黄黄夹夹次苷次苷CCH2OHH黄黄夹夹次苷次苷DCOOHH单单乙乙酰酰黄黄夹夹次苷次苷BCH3H单乙酰黄夹次苷单乙酰黄夹次苷B R=COCH3 ,其它其它R=H 答案：答案：1：极性大：极性大极性小，黄夹苷极性小，黄夹苷A 黄夹

16、苷黄夹苷B 黄黄夹次苷夹次苷D 黄夹次苷黄夹次苷C 黄夹次苷黄夹次苷A 黄夹次黄夹次苷苷B 单乙酰黄夹次苷单乙酰黄夹次苷B2：从硅胶柱上被洗脱下来的顺序：极性小的：从硅胶柱上被洗脱下来的顺序：极性小的先被洗出，极性大的后被洗出。先被洗出，极性大的后被洗出。3、活性炭活性炭-非极性吸附剂非极性吸附剂 吸附力与结构的关系吸附力与结构的关系 分子量大者分子量大者 分子量小者分子量小者芳香族芳香族 脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型分子的缘故。分子的缘故。含含OH、COOH、NH2多者多者 少者少者 3、活性炭、活性炭-非极性吸附剂非极性吸附剂 溶剂的洗脱力溶剂的洗脱力

17、吡啶吡啶 15%酚酚/醇醇 7%酚酚/H2O 醇醇 含水醇含水醇 H2O 黄酮、生物碱的富集，糖的分离，脱色等。黄酮、生物碱的富集，糖的分离，脱色等。应用应用 4、聚酰胺（、聚酰胺（Polyamide）由己酰胺聚合成的一类高分子化合物。由己酰胺聚合成的一类高分子化合物。分离原理：主要分离原理：主要通过通过酰胺酰胺与与酚、酚、酸、醌酸、醌等化合物等化合物形成氢键形成氢键，吸附，吸附能力取决于氢键能力取决于氢键的强弱。的强弱。4、聚酰胺、聚酰胺 吸附能力与化合物结构的关系吸附能力与化合物结构的关系 a.形成氢键的基团数目越多，吸附力越强；形成氢键的基团数目越多，吸附力越强；4、聚酰胺、聚酰胺 b.

18、形成分子内氢键者，吸附力减弱；形成分子内氢键者，吸附力减弱；c.分子中芳香化程度高，则吸附性增强；反之，分子中芳香化程度高，则吸附性增强；反之，则减弱；则减弱；4、聚酰胺、聚酰胺溶剂洗脱能力强弱溶剂洗脱能力强弱 尿素水溶液尿素水溶液 二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺 甲酰胺甲酰胺 NaOH水溶液水溶液 丙酮丙酮 甲醇甲醇 水水 聚酰胺色谱的应用聚酰胺色谱的应用4、聚酰胺、聚酰胺聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的（鞣质例外），分离效果好，吸附容量大，可逆的（鞣质例外），分离效果好，吸附容量大，特别适合于该类物质的制备与分离。特别适合于该类物质的制备与分离。

19、也可用于生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基也可用于生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离；酸等其它极性与非极性化合物的分离；聚酰胺对鞣质的吸附特别强，近乎不可逆，聚酰胺对鞣质的吸附特别强，近乎不可逆，特别适合于植物粗提物的脱鞣处理。特别适合于植物粗提物的脱鞣处理。二、沉淀法二、沉淀法 在提取液中加入某些溶剂使产生沉淀，以获在提取液中加入某些溶剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法得有效成分或除去杂质的方法。1、乙醇沉淀法、乙醇沉淀法 2、酸碱沉淀法、酸碱沉淀法3、铅盐沉淀法、铅盐沉淀法 浓提取液中的有效成分在乙醇中不溶或溶解浓提取液中的有效成分在乙醇中不溶或溶解度小。

20、度小。如：淀粉、树胶、蛋白质、某些多糖。如：淀粉、树胶、蛋白质、某些多糖。1、乙醇沉淀法、乙醇沉淀法特别适合于多糖的分离多糖。特别适合于多糖的分离多糖。如：内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生如：内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐而溶于水，酸化又析出。成羧酸盐而溶于水，酸化又析出。2、酸碱沉淀法、酸碱沉淀法利用某些成分在酸（或碱）中溶解，又在利用某些成分在酸（或碱）中溶解，又在碱（或酸）中沉淀的性质达到分离的方法。碱（或酸）中沉淀的性质达到分离的方法。蛔蒿中提取驱蛔有效成分山道年蛔蒿中提取驱蛔有效成分山道年 蛔蒿粉末用石灰乳调匀，加热水提取，山道蛔蒿粉末用石灰乳调匀，加热水提取，山道年成

21、为山道年酸钙被水提出，水提取液过滤浓缩年成为山道年酸钙被水提出，水提取液过滤浓缩后，加酸酸化，山道年沉淀析出，滤集，用乙酸后，加酸酸化，山道年沉淀析出，滤集，用乙酸重结晶可得纯品。重结晶可得纯品。生物碱不溶于水，遇酸生成盐而溶于水，生物碱不溶于水，遇酸生成盐而溶于水，碱化又重新生成游离生物碱。碱化又重新生成游离生物碱。生物碱沉淀剂可形成不溶性复盐而析出。生物碱沉淀剂可形成不溶性复盐而析出。如雷氏铵盐如雷氏铵盐NH4Cr(NH3)2(SCN)4 陈皮甙，黄芩甙等均可用酸碱沉淀法制备。陈皮甙，黄芩甙等均可用酸碱沉淀法制备。R=葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸 3、铅盐沉淀法、铅盐沉淀法 中性中性Pb(Ac)2

22、或或Pb(OH)Ac在水或稀醇中，在水或稀醇中，能与多种成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，利能与多种成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，利用此性质使有效成分与杂质分离。用此性质使有效成分与杂质分离。中性醋酸铅可沉淀：有机酸、蛋白质、氨中性醋酸铅可沉淀：有机酸、蛋白质、氨基酸、鞣质、树脂、酸性皂甙等。基酸、鞣质、树脂、酸性皂甙等。碱性醋酸铅可沉淀除上述外，另加醇性羟基、碱性醋酸铅可沉淀除上述外，另加醇性羟基、酮基、醛基、中性皂甙、异黄酮、糖类。酮基、醛基、中性皂甙、异黄酮、糖类。将铅盐悬浮于新溶剂中，通入将铅盐悬浮于新溶剂中，通入H2S，使其分，使其分解为解为PbS，得有效成分。，得有效成分。也可用也可用

23、H2SO4、Na2SO4、H3PO4、Na3PO4脱脱铅。铅。脱铅脱铅 三、盐析法三、盐析法 在有效成分提取液中，加入无机盐使溶解在有效成分提取液中，加入无机盐使溶解至一定浓度或达饱和状态，可使某些成分在水至一定浓度或达饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低，析出沉淀与水溶性大的杂质中的溶解度降低，析出沉淀与水溶性大的杂质分离。分离。常用盐：常用盐：NaCl、Na2SO4、MgSO4、(NH4)2SO4例：三七水提取液中，加例：三七水提取液中，加MgSO4到饱和状态，到饱和状态，三三七皂甙即可沉淀析出。七皂甙即可沉淀析出。三颗针中提取黄连素，加三颗针中提取黄连素，加NaCl饱和，小薜饱和，小

24、薜碱粗品析出。碱粗品析出。四、透析法四、透析法 利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，大利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，大分子则不能通过半透膜的性质进行分离的方法。分子则不能通过半透膜的性质进行分离的方法。如分离纯化皂甙、蛋白质、如分离纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等大分子时，用此法多肽、多糖等大分子时，用此法可除无机盐、单、双糖等小分子可除无机盐、单、双糖等小分子杂质杂质。透析膜的膜孔有大有小，视透析膜的膜孔有大有小，视具体情况而选择，常用透析膜：具体情况而选择，常用透析膜：动物性膜、火棉胶膜、硫酸纸膜、动物性膜、火棉胶膜、硫酸纸膜、玻璃纸膜等。玻璃纸膜等。五、结晶、重结晶和分步结晶五、结晶

25、、重结晶和分步结晶 六、层析法六、层析法 1 1、柱层析、柱层析2 2、薄层层析、薄层层析3 3、纸层析、纸层析4 4、凝胶层析、凝胶层析（又称凝胶过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、（又称凝胶过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析等）排阻层析等）4、凝胶层析、凝胶层析（Gel Penetration Chromatography,GPC）葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 交联葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交联葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂（一般为环氧氯丙烷）以醚桥的形式互相交联剂（一般为环氧氯丙烷）以醚桥的形式互相交联形成的三维空间网状结构高分子材料，是水交联形成的三维空间网状结构高分子材料

26、，是水不溶性的白色球状颗粒，酸性环境能水解，碱中不溶性的白色球状颗粒，酸性环境能水解，碱中稳定。稳定。在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经路径的不同，使不同相对分子量的组分得以流经路径的不同，使不同相对分子量的组分得以分离的方法。分离的方法。表面有孔隙，其大小决定于聚糖与交联剂表面有孔隙，其大小决定于聚糖与交联剂的配比及反应条件。的配比及反应条件。商品型号即按凝胶的交联度大小分类，并商品型号即按凝胶的交联度大小分类，并以吸水量来表示，英文字母以吸水量来表示，英文字母G代表葡聚糖凝胶，代表葡聚糖凝胶，后面的数字表示每克凝胶吸水量，再乘以后面的数字表示每

27、克凝胶吸水量，再乘以10的的值，值，G-25的吸水量为每克的吸水量为每克2.5ml。交联度大交联度大网状结构越紧密网状结构越紧密孔隙越小孔隙越小吸吸水膨胀越少。水膨胀越少。型号型号吸水量吸水量（ml/g）床体床体积积（ml/g）分离范分离范围围最小溶最小溶胀时间胀时间肽肽与蛋白与蛋白质质多糖多糖室温室温沸水沸水G-101.023小于小于700小于小于70031G-151.52.53.5小于小于1500小于小于150031G-252.54610005000100500062G-505.091115003万万5001万万62G-757.5121530007万万10005万万243G-1001015

28、20400015万万100010万万485G-150152030500040万万100015万万725G-200203040500080万万100020万万725凝胶的型号与使用范围凝胶的型号与使用范围 层析原理层析原理 绝大部分在水溶液中进行，凝胶颗粒在适当绝大部分在水溶液中进行，凝胶颗粒在适当溶剂中浸泡，待充分膨胀后装入层析柱，加样后溶剂中浸泡，待充分膨胀后装入层析柱，加样后用同一溶液洗脱。在洗脱过程中，较小的分子渗用同一溶液洗脱。在洗脱过程中，较小的分子渗入凝胶，较大的分子随溶液流动，分子量小的物入凝胶，较大的分子随溶液流动，分子量小的物质（阻滞作用大）可通过凝胶网孔进入粒子内部，质（阻

29、滞作用大）可通过凝胶网孔进入粒子内部，然后扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出然后扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出色谱柱，分子量大的物质沉凝胶粒子间孔隙，随色谱柱，分子量大的物质沉凝胶粒子间孔隙，随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先流出色谱洗脱液移动，流程短，移动速度快，先流出色谱柱。柱。不同的化合物由于其大小差异，在流经不同的化合物由于其大小差异，在流经GPC柱时，不同柱时，不同分子量的化合物流经体积不同（大分子不能或难以进入凝胶分子量的化合物流经体积不同（大分子不能或难以进入凝胶网格结构的内部，直接从凝胶颗粒之间穿过，保留时间短；网格结构的内部，直接从凝胶颗粒之间穿过，保留时间短；

30、而小分子恰恰相反，保留时间较长）而得以分离而小分子恰恰相反，保留时间较长）而得以分离。常用术语常用术语Vt 床体积，凝胶装柱以后，柱床所占的体积。床体积，凝胶装柱以后，柱床所占的体积。Vo外水体积，柱床内存在于凝胶外面的水相外水体积，柱床内存在于凝胶外面的水相体积。体积。Vi内水体积，凝胶颗粒内部所含的水相体积。内水体积，凝胶颗粒内部所含的水相体积。Vg凝胶本身体积。凝胶本身体积。相互关系：相互关系：Vt=Vo+Vi+VgVe洗脱体积，自样品加入时算起，至流出组洗脱体积，自样品加入时算起，至流出组分最大浓度出现时，所流出的体积分最大浓度出现时，所流出的体积。同一类型化合物，洗脱特征与组分分子量

31、有同一类型化合物，洗脱特征与组分分子量有关。关。Ve=K1-K2logM 说明不同组分流经凝胶柱时，按分子量大小说明不同组分流经凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的，洗脱体积小，最先流出，顺序流出，分子量大的，洗脱体积小，最先流出，当条件固定时，当条件固定时，Ve重现性很好。重现性很好。按此特性可测大分子物质的分子量。按此特性可测大分子物质的分子量。用已知分子量的物质用已知分子量的物质分别相继上柱（分别相继上柱（5mg），），流出液按每管流出液按每管24ml收集，收集，通过硫酸蒽酮显色，再经通过硫酸蒽酮显色，再经紫外检测，分别求得洗脱紫外检测，分别求得洗脱体积体积Ve。再用蓝色葡聚糖。再

32、用蓝色葡聚糖测出柱床的外水体积测出柱床的外水体积Vo，按按Ve/Vo与分子量对数关与分子量对数关系作图，得标准曲线，最系作图，得标准曲线，最后将待测物质分子量用少后将待测物质分子量用少水溶解上柱，在同样条件水溶解上柱，在同样条件下测定下测定Ve，根据，根据Ve/Vo，查标准曲线，测得物质分查标准曲线，测得物质分子量。子量。局限性：局限性：1、要有标准样。、要有标准样。2、不同的待测物质、不同的待测物质要有不同的标准样。要有不同的标准样。操作技术：操作技术：溶胀：溶胀：不同凝胶溶胀时间不一样，不同凝胶溶胀时间不一样，G-100室温下最室温下最小水化时间小水化时间72h，除微颗粒。目的：充分吸水，

33、各，除微颗粒。目的：充分吸水，各孔隙舒张，以利于物质分子通过。孔隙舒张，以利于物质分子通过。装柱：装柱：柱内加少量洗脱液，排除底部气泡，然后将柱内加少量洗脱液，排除底部气泡，然后将凝胶浆倒入，让其自然沉降，打开出口，柱床表面凝胶浆倒入，让其自然沉降，打开出口，柱床表面不再下沉即紧密。装好的柱应不含气泡，柱床表面不再下沉即紧密。装好的柱应不含气泡，柱床表面平坦。平坦。平衡：平衡：用用3倍床体积洗脱液让柱平衡流动倍床体积洗脱液让柱平衡流动2-3天，天，至流速恒定。至流速恒定。加样：加样：平衡后，床表面应有平衡后，床表面应有12cm的洗脱液，的洗脱液，用吸管沿柱壁加入，打开出口，当上面液体刚用吸管沿

34、柱壁加入，打开出口，当上面液体刚好全部渗入柱内时，滴加洗脱液，注意不能振好全部渗入柱内时，滴加洗脱液，注意不能振动床表面。动床表面。上样品要体积小，浓度大，这样峰形好。上样品要体积小，浓度大，这样峰形好。洗脱：洗脱：一般用水和电解质溶液，如酸、碱、盐的一般用水和电解质溶液，如酸、碱、盐的溶液及缓冲溶液。加入溶液及缓冲溶液。加入5cm以上洗脱液时，可接高以上洗脱液时，可接高位瓶中的洗脱液，位瓶中的洗脱液，洗脱分阶段洗脱和梯度洗脱洗脱分阶段洗脱和梯度洗脱收集：收集：分部收集器收集。分部收集器收集。检出：检出：蛋白质、核苷酸、多肽用紫外光谱仪在蛋白质、核苷酸、多肽用紫外光谱仪在280nm、260nm

35、、230nm测吸光度值，以样品体积测吸光度值，以样品体积（或管数）为横座标，吸光度为纵座标，画出洗脱（或管数）为横座标，吸光度为纵座标，画出洗脱曲线。曲线。1、气相色谱、气相色谱2、液相色谱、液相色谱3、制备色谱、制备色谱八、仪器八、仪器气相色谱仪的原理和结构气相色谱仪的原理和结构 第三节第三节天然产物的鉴定天然产物的鉴定鉴定天然产物所需做的工作鉴定天然产物所需做的工作1、元素分析、元素分析 由哪些元素组成，各占多少。由哪些元素组成，各占多少。2、物理常数、物理常数 熔、沸点熔、沸点3、比旋光度、比旋光度4、分子量、凝胶过滤法、光散射法、粘度测定、分子量、凝胶过滤法、光散射法、粘度测定法、法、

36、MS等方法等方法5、结构测定法：红外光谱、核磁共振（、结构测定法：红外光谱、核磁共振（13C谱谱、1H谱和二维谱）谱和二维谱）一、化学方法一、化学方法 二、仪器方法二、仪器方法 波长在波长在200400nm分子吸收紫外线引起分子分子吸收紫外线引起分子价键电子跃迁，由于价电子跃迁的能级固不同的价键电子跃迁，由于价电子跃迁的能级固不同的而各异。而各异。1、紫外光谱、紫外光谱 饱和饱和键键*跃迁，不出现吸收带。跃迁，不出现吸收带。共轭双键共轭双键 *和和n*跃迁。跃迁。紫外主要用于是否含有共轭体系的鉴定，如紫外主要用于是否含有共轭体系的鉴定，如苯在苯在256nm出现出现B带。带。OH 3600cm-

37、1左右，因缔合，峰较宽；左右，因缔合，峰较宽；C=O 1700cm-1附近，随所连基团的供电子强弱附近，随所连基团的供电子强弱而向上或向下移动。而向上或向下移动。2、红外光谱、红外光谱测定分子中存在的官能团种类。测定分子中存在的官能团种类。3、质谱、质谱 确定分子量确定分子量4、氢核磁共振谱、氢核磁共振谱 确定氢的个数及相互关系确定氢的个数及相互关系5、旋光光谱、旋光光谱 具有旋光性的天然产物，测定其构型和构象具有旋光性的天然产物，测定其构型和构象6、元素分析、元素分析 测定测定C、H、N、S元素含量。元素含量。7、核磁共振谱核磁共振谱 确定分子骨架。确定分子骨架。酚酚UV280nm，IR15

38、001600、3300cm-1，溶于，溶于NaOH黄酮黄酮 黄色或淡黄结晶，黄色或淡黄结晶，UV240285nm及及300400nm各一各一峰，峰，IR在在15001700cm-1有吸收。有吸收。皂甙皂甙1H谱在高场有山峰形及几个甲基尖峰信号。谱在高场有山峰形及几个甲基尖峰信号。香豆素香豆素UV240260nm，IR15001600cm-1，有芳环吸收；，有芳环吸收；320nm吡喃酮环结构，吡喃酮环结构，1700cm-1附近有不饱和内酯附近有不饱和内酯吸收峰吸收峰；1H谱主要为芳香质子信号。谱主要为芳香质子信号。三、中药指纹图谱质量控制三、中药指纹图谱质量控制借助计算机、信息及先进的物理、化学

39、技术，借助计算机、信息及先进的物理、化学技术，将中药的特性和有效成分，采用图谱的形式描将中药的特性和有效成分，采用图谱的形式描绘出来，从而鉴定真伪、辨认优劣、确定其质绘出来，从而鉴定真伪、辨认优劣、确定其质量和有效性。量和有效性。红外光谱指纹图谱红外光谱指纹图谱高效液相色谱高效液相色谱-质谱指纹图谱质谱指纹图谱气相色谱气相色谱-质谱指纹图谱质谱指纹图谱质谱指纹图谱质谱指纹图谱 紫外光谱指纹图谱紫外光谱指纹图谱X-射线衍射指纹图谱射线衍射指纹图谱包括：包括：柚肉汁提取成分的高效液相色谱指纹图谱柚肉汁提取成分的高效液相色谱指纹图谱 植物药是多种化学成分的混合体，其药效不植物药是多种化学成分的混合体

40、，其药效不是单一的组份能说明的，是多种活性组份共同起是单一的组份能说明的，是多种活性组份共同起作用的，因此单一活性组份的测定和评价不能说作用的，因此单一活性组份的测定和评价不能说明中药质量的好坏，而且目前很多检测的指标成明中药质量的好坏，而且目前很多检测的指标成分不具唯一性，将西药检测的理念完全应用于中分不具唯一性，将西药检测的理念完全应用于中药存在以偏盖全，割离整体作用的问题。药存在以偏盖全，割离整体作用的问题。植物药材的质量随产地、气候、生产工艺而植物药材的质量随产地、气候、生产工艺而不同，建立一种代表性的整体性识别方式，将各不同，建立一种代表性的整体性识别方式，将各种共同的特征用一个图谱

41、表现出来受到重视。种共同的特征用一个图谱表现出来受到重视。指纹图谱是在某一方面从整体上来确定特定指纹图谱是在某一方面从整体上来确定特定研究对象（如中药材，提取物，饮片，注射液等）研究对象（如中药材，提取物，饮片，注射液等）组成的一种方法，是一种模糊识辨方式。比较适组成的一种方法，是一种模糊识辨方式。比较适合于中药这种复杂体系的表征。合于中药这种复杂体系的表征。但其也有局限性：但其也有局限性：1、图谱反映的内容不够全面。、图谱反映的内容不够全面。2、图谱与具体的成分结构还有一定的差距。、图谱与具体的成分结构还有一定的差距。应用某种实用的方法，找出代表性相对更应用某种实用的方法，找出代表性相对更强的图谱进行表征是指纹图谱研究的重点。强的图谱进行表征是指纹图谱研究的重点。