粗糙链孢霉有性杂交的四分子分析.ppt

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1、粗糙链孢霉有性杂交的四分子分析一、一、相关理论知识相关理论知识二、二、目的要求目的要求三、三、实验原理实验原理四、四、试剂与器材试剂与器材五、五、实验步骤实验步骤六、六、实验结果实验结果七、七、注意事项注意事项八、八、思考题思考题吉林大学生物基础实验吉林大学生物基础实验教学中心教学中心相关理论知识(1)链孢霉链孢霉俗称红霉菌。链孢霉菌丝生长疏松，呈棉絮状，俗称红霉菌。链孢霉菌丝生长疏松，呈棉絮状，白色，分生孢子成串悬挂在气生菌丝上，呈桔红色，链白色，分生孢子成串悬挂在气生菌丝上，呈桔红色，链孢霉广泛分布于自然界土壤中和禾木科植物上，分生孢孢霉广泛分布于自然界土壤中和禾木科植物上，分生孢子在空气

2、中飘浮，靠气流传播，是高温季节发生的最重子在空气中飘浮，靠气流传播，是高温季节发生的最重要的杂菌。要的杂菌。7-9月是盛发高峰。在月是盛发高峰。在20-30条件下，遇适条件下，遇适合合的栽培料，蔓延迅速，传播力强，菌丝生长阶段一旦发的栽培料，蔓延迅速，传播力强，菌丝生长阶段一旦发现菌袋上感染链孢霉，三天后整个生产场地都布满了链现菌袋上感染链孢霉，三天后整个生产场地都布满了链孢霉的孢子，有时会造成毁灭性危害。防止链孢霉蔓延孢霉的孢子，有时会造成毁灭性危害。防止链孢霉蔓延的最简单方法是发生部位涂上煤油柴油等可控制其危的最简单方法是发生部位涂上煤油柴油等可控制其危害。害。链链孢孢霉霉有有两两种种繁繁

3、殖殖方方式式，一一种种是是无无性性繁繁殖殖，当当其其孢孢子子（N）或或菌菌丝丝落落在在营营养养物物上上，孢孢子子萌萌发发，菌菌丝丝生生长长形形成成菌菌丝丝体体（N）。另另一一种种是是有有性性繁繁殖殖，两两个个亲亲本本必必须须是是不不同同的的交交配配型型（matigtype）A和和a，各各自自的的分分生生孢孢子子会会散散落落在在不不同同交交配配型型子子实实体体的的受受精精丝丝上上，进进入入子子实实体体，进进行行核核融融合合，形形成成2n核核，（A/a）。二二倍倍体体时时期期十十分分短短暂暂，很很快快进进行行减减数数分分裂裂，最最后后再再经经过过一一次次有有丝丝分分裂裂，在在子子囊囊中中产产生生8

4、个个单单倍倍体体的的子子囊囊孢孢子子，子子囊囊孢孢子子成成熟熟后后有有可可萌萌发发，长长成成新新的的菌菌丝体。丝体。相关理论知识相关理论知识(2)相关理论知识(3)链孢霉后代多，样本大，统计分析的误差小，生活周期段链孢霉后代多，样本大，统计分析的误差小，生活周期段短，在短时间内可获得结果。链孢霉易培养和操作，可利短，在短时间内可获得结果。链孢霉易培养和操作，可利用选择培养基筛选各种突变型；链孢霉又属真核生物，可用选择培养基筛选各种突变型；链孢霉又属真核生物，可作为真核的研究模型，因此是很好的遗传学实验材料。子作为真核的研究模型，因此是很好的遗传学实验材料。子囊孢子是单倍体，不存在显隐性的问题，

5、表型和基因型一囊孢子是单倍体，不存在显隐性的问题，表型和基因型一致；孢子按顺序排列在子囊中，我们称其为顺序四分子（致；孢子按顺序排列在子囊中，我们称其为顺序四分子（Orderedtetrad），经过分析易于确定是否是重组类型及），经过分析易于确定是否是重组类型及基因的转变，其着丝粒本身也可看作是一个位点来研究，基因的转变，其着丝粒本身也可看作是一个位点来研究，因此在四分体时期进行遗传分析是很方便的，这种方法称因此在四分体时期进行遗传分析是很方便的，这种方法称为四分子分析（为四分子分析（terardanalysis）。）。目的要求1、学习菌种活化法、学习菌种活化法,杂交方法及培养基配制杂交方法及

6、培养基配制方法。方法。2、了解顺序排列的四分子遗传分析方法。、了解顺序排列的四分子遗传分析方法。3、掌握有关基因与着丝粒距离的计算和作图。、掌握有关基因与着丝粒距离的计算和作图。实验原理链孢霉（链孢霉（Neurosporacrassa）属真菌类，染色体为）属真菌类，染色体为n倍，倍，繁繁殖方式可以有营养体菌丝或分生孢子经有丝分裂直接发育殖方式可以有营养体菌丝或分生孢子经有丝分裂直接发育成菌丝体，并产生大量的分生孢子。如果把两个不同品系成菌丝体，并产生大量的分生孢子。如果把两个不同品系链孢霉接种杂交培养基上，链孢霉又能进行有性生殖。在链孢霉接种杂交培养基上，链孢霉又能进行有性生殖。在有性生殖时，

7、菌丝体的顶端，分生孢子的基部先长出一个有性生殖时，菌丝体的顶端，分生孢子的基部先长出一个原子囊果，类似高等植物的性器官，原子囊果能接受来自原子囊果，类似高等植物的性器官，原子囊果能接受来自不同品系菌丝体上的分生孢子，原来不同品系菌丝体上的分生孢子，原来n倍的原子囊果就变倍的原子囊果就变成了成了2n的子囊果，这个的子囊果，这个2倍体的合子经过减数分裂形成倍体的合子经过减数分裂形成4个个子细胞，每个子细胞又经过一次有丝分裂，使原来的子细胞，每个子细胞又经过一次有丝分裂，使原来的4个个细胞变成细胞变成8个细胞，这个细胞，这8个细胞进一步发育成个细胞进一步发育成8个子囊孢子个子囊孢子排列在一个子囊中，

8、它们是一次减数分裂的产物。排列在一个子囊中，它们是一次减数分裂的产物。实验原理有性杂交是在形状不同的两个品系中进行的，子囊孢子的有性杂交是在形状不同的两个品系中进行的，子囊孢子的颜色有黑有白，通过杂交产生的颜色有黑有白，通过杂交产生的8个子囊孢子应该是个子囊孢子应该是4黑黑4白，但排列的方式有不同，这是由于染色体交换引起的。白，但排列的方式有不同，这是由于染色体交换引起的。减数分裂同源染色体配对时，减数分裂同源染色体配对时，4条染色单体发生交换的概条染色单体发生交换的概率相同，造成率相同，造成8个子囊孢子有个子囊孢子有4种排列方式，加上没有交换种排列方式，加上没有交换亲组合亲组合2种排列方式，

9、种排列方式，8个子囊孢子一共有个子囊孢子一共有6种排列方式，种排列方式，这是显微镜下可以直接观察到的。把观察到的子囊数目进这是显微镜下可以直接观察到的。把观察到的子囊数目进行整理，按下列公式计算：重组值行整理，按下列公式计算：重组值=交换子囊数交换子囊数/子囊总数子囊总数100%100%1/21/2得到的重组值就是该性状在染色体上距着粒得到的重组值就是该性状在染色体上距着粒之间的距离。之间的距离。试剂与器材1、材料：（、材料：（1）野生型粗糙链孢霉，自身可以合成赖氨酸，用）野生型粗糙链孢霉，自身可以合成赖氨酸，用lys+表表示。子囊孢子是黑色的。示。子囊孢子是黑色的。（2）赖氨酸缺陷型粗糙链孢

10、霉，自身失去合成赖氨酸的能）赖氨酸缺陷型粗糙链孢霉，自身失去合成赖氨酸的能力，必须在培养基中添加赖氨酸才能生长，用力，必须在培养基中添加赖氨酸才能生长，用lys-表示。表示。子囊孢子是白色的。链孢霉染色体数子囊孢子是白色的。链孢霉染色体数n=7，是单倍体。，是单倍体。没没有同源染色体，也就没有基因的显隐性，染色体上基因有同源染色体，也就没有基因的显隐性，染色体上基因控制的性状可以直接在子代中表现出来。另外链孢霉进控制的性状可以直接在子代中表现出来。另外链孢霉进行有性生殖，通过两个不同性状亲本之间的杂交，可以行有性生殖，通过两个不同性状亲本之间的杂交，可以直接在显微镜下观察到染色体的分离交换现象

11、。直接在显微镜下观察到染色体的分离交换现象。2、试剂：琼脂、蔗糖、赖氨酸、玉米粒、次氯酸钠、马铃薯、试剂：琼脂、蔗糖、赖氨酸、玉米粒、次氯酸钠、马铃薯3、器材：恒温培养箱、高压灭菌器、烧杯、量筒、天平、试管、滤纸、器材：恒温培养箱、高压灭菌器、烧杯、量筒、天平、试管、滤纸片、载玻片、盖玻片、记号笔、玻璃棒、药匙片、载玻片、盖玻片、记号笔、玻璃棒、药匙实验步骤1、配制菌种活化培养基（、配制菌种活化培养基（1）基本培养基）基本培养基（供（供lys+活化用），将土豆去皮洗净，活化用），将土豆去皮洗净，切成切成0.5cm3小块，分别装入试管中，每小块，分别装入试管中，每个试管个试管57块。块。2%的琼

12、脂条和的琼脂条和2%蔗糖蔗糖煮沸溶解后分装在有土豆块的试管中，煮沸溶解后分装在有土豆块的试管中，经经121，高压灭菌，高压灭菌15min后，制做斜面后，制做斜面备用。（备用。（2）补充培养基（供）补充培养基（供lys-活化用）活化用），在基本培养基中按，在基本培养基中按5mg/100mL加入赖加入赖氨酸即为补充培养基，其它相同。氨酸即为补充培养基，其它相同。实验步骤2、菌种活化：从冰箱中取出、菌种活化：从冰箱中取出lys+和和lys-菌种，菌种，在无菌条件下把在无菌条件下把lys+接在基本培养基上，把接在基本培养基上，把lys-接在补充培养基上。接种好的试管放在接在补充培养基上。接种好的试管放

13、在25条件下培养条件下培养56天，直至试管中长出天，直至试管中长出许多菌丝，并且有大量的分生孢子时，表许多菌丝，并且有大量的分生孢子时，表明菌种已经活化好。菌种活化时间不要过明菌种已经活化好。菌种活化时间不要过长，否则菌丝和分生孢子已经老化，影响长，否则菌丝和分生孢子已经老化，影响杂交成功率。杂交成功率。实验步骤3、配制杂交培养基：将玉米粒浸泡、配制杂交培养基：将玉米粒浸泡24h后洗后洗净，每支试管装净，每支试管装3粒。粒。将将2%的琼脂条和的琼脂条和2%蔗糖煮沸溶解后分装在有玉米粒的试管蔗糖煮沸溶解后分装在有玉米粒的试管中，经中，经121，高压灭菌，高压灭菌15min后，制做斜后，制做斜面备

14、用。面备用。实验步骤4、杂交：将活化好的菌种、杂交：将活化好的菌种lys+和和lys-同时接同时接到杂交培养基上，接种菌丝体和分生孢子到杂交培养基上，接种菌丝体和分生孢子都可以。接种完以后，在培养基表面放一都可以。接种完以后，在培养基表面放一小块滤纸片，接种后的试管放在小块滤纸片，接种后的试管放在25恒温恒温培养箱中二周左右便有黑色颗粒状子囊果培养箱中二周左右便有黑色颗粒状子囊果出现，但还没有完全成熟，到三周左右，出现，但还没有完全成熟，到三周左右，子囊果基本成熟，可以在显微镜下观察，子囊果基本成熟，可以在显微镜下观察，观察的最佳时间是杂交后的观察的最佳时间是杂交后的2325天这段天这段时间内

15、。时间内。实验步骤5、显微镜观察（、显微镜观察（1）先把长有子囊果的试管中加入）先把长有子囊果的试管中加入少量无菌水充分摇动，把水倒入烧杯中加热煮沸，少量无菌水充分摇动，把水倒入烧杯中加热煮沸，防止分生孢子飞扬。（防止分生孢子飞扬。（2）用接种针挑选个大饱满）用接种针挑选个大饱满的子囊果放在载玻片上，滴上一滴的子囊果放在载玻片上，滴上一滴5%次氯酸钠溶次氯酸钠溶液浸泡液浸泡2min左右。次氯酸钠的作用是对子囊果壁左右。次氯酸钠的作用是对子囊果壁起腐蚀作用，以便将子囊果压破。压片时用力不起腐蚀作用，以便将子囊果压破。压片时用力不宜过大，因为一次分裂产生的宜过大，因为一次分裂产生的8个子囊孢子顺序

16、的个子囊孢子顺序的排列在一个子囊中，观察时要以子囊为单位进行排列在一个子囊中，观察时要以子囊为单位进行统计，若用力过大，统计，若用力过大，8个子囊孢子被压出子囊都分个子囊孢子被压出子囊都分散开了，不利于观察。散开了，不利于观察。实验结果子囊类型子囊类型观察数观察数+总计总计实验结果实验结果分析经过显微镜下的观察，子囊孢子的排列方式经过显微镜下的观察，子囊孢子的排列方式有以下有以下6种：种：第一次分裂分离子囊（亲本类型）第一次分裂分离子囊（亲本类型）（1）+（2）+第二次分裂分离子囊（重组类型）第二次分裂分离子囊（重组类型）（3）+（4）+（5）+（6）+产生（产生（1）和（）和（2）两种亲本类

17、型，是因为没有染色体之）两种亲本类型，是因为没有染色体之间的交换。间的交换。注意事项1、培养菌种是要注意培养温度。、培养菌种是要注意培养温度。2、杂交后的菌种要注意培养时间。、杂交后的菌种要注意培养时间。3、接菌时要注意无菌操作。、接菌时要注意无菌操作。4、制片时要注意次氯酸钠的浸泡时间。、制片时要注意次氯酸钠的浸泡时间。5、滤纸片的边缘不应有毛边，防止吸水时将、滤纸片的边缘不应有毛边，防止吸水时将孢子吸附掉。孢子吸附掉。思考题1、将数据代入公式，计算交换值。、将数据代入公式，计算交换值。2、画遗传学图，把基因定位染色体上。、画遗传学图，把基因定位染色体上。3、用染色体图示表明、用染色体图示表明6种子囊类型的形成种子囊类型的形成过程。过程。4、说明、说明5%次氯酸钠在本实验中的作用。次氯酸钠在本实验中的作用。