总RNA的提取与电泳.ppt

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1、RNARNA的提取与电泳的提取与电泳实实 验验 三三动物组织总动物组织总RNARNA的提取与电泳的提取与电泳四川大学基础医学与法医学院生物化学与分子生物学四川大学基础医学与法医学院生物化学与分子生物学四川大学基础医学与法医学院生物化学与分子生物学四川大学基础医学与法医学院生物化学与分子生物学 廖英廖英廖英廖英1/24/20231RNARNA的提取与电泳的提取与电泳1.1.实验目的和要求实验目的和要求2.2.相关基础知识相关基础知识3.3.实验方法、步骤和实验方法、步骤和注意事项注意事项1/24/20232RNARNA的提取与电泳的提取与电泳一一.实验目的和要求实验目的和要求 掌握掌握RNA制备

2、以及常用鉴定方法制备以及常用鉴定方法的原理、操作步骤、注意事项和技术的原理、操作步骤、注意事项和技术关键。关键。1/24/20233RNARNA的提取与电泳的提取与电泳二二.相关基础知识相关基础知识1.RNA的种类和作用的种类和作用 细胞内的细胞内的RNA主要是主要是 rRNA、tRNA及及mRNA和小分子和小分子RNA 。rRNA含量最丰富含量最丰富，由由2S、18S、5.8S和和5S几类组成。几类组成。mRNA种种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等类繁多，分子量从数百至数千碱基不等。1/24/20234RNARNA的提取与电泳的提取与电泳 RNA是是基因表达过程中非常重要的生物基因表达过程

3、中非常重要的生物分子，如分子，如mRNA,它携带了它携带了DNA的全部编码的全部编码信息。信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。础之一，在分子生物学中占有重要的地位。1/24/20235RNARNA的提取与电泳的提取与电泳2.应用应用总总RNA制备在分子克隆中有广泛应用，可用于：制备在分子克隆中有广泛应用，可用于：1 Northern blotting 2 通过通过 Oligo(dT)制备制备 mRNA 3 通过反转录聚合酶链反应（通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）建立）建立cDNA文库文库 4 用于消减杂交和消减文库的构

4、建，筛选差异用于消减杂交和消减文库的构建，筛选差异表达基因表达基因 5 体外蛋白质的生物合成体外蛋白质的生物合成1/24/20236RNARNA的提取与电泳的提取与电泳苯酚法：用苯酚法：用SDSSDS变性蛋白并抑制变性蛋白并抑制RNaseRNase活性，活性，经多次酚经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用等后，用NaACNaAC和乙醇沉淀和乙醇沉淀RNARNA；胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙巯基乙醇变性蛋白，并抑制醇变性蛋白，并抑制RNaseRNase的活性，经酚氯的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；仿抽提后再沉淀；氯化锂沉淀

5、法：因为锂在在一定氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pHpH下能使下能使RNARNA相对特异地沉淀，但容易使小分子相对特异地沉淀，但容易使小分子RNARNA损损失，而且残留的锂离子对失，而且残留的锂离子对mRNAmRNA有抑制作用。有抑制作用。3.3.常用方法常用方法 已有多种较为成熟的分离总已有多种较为成熟的分离总RNARNA的方法，常的方法，常用的有用的有3 3种种:1/24/20237RNARNA的提取与电泳的提取与电泳本实验采用本实验采用胍盐法胍盐法。其原理是：其原理是：在解偶联剂异硫氰酸胍作用下，蛋在解偶联剂异硫氰酸胍作用下，蛋白质与白质与RNA解偶联；利用蛋白质为解偶联；利用蛋白质为酚酚

6、氯仿氯仿异戊醇变性后可除去异戊醇变性后可除去 ；而而RNARNA不溶于不溶于50%50%异丙醇析出得到分异丙醇析出得到分离纯化。离纯化。1/24/20238RNARNA的提取与电泳的提取与电泳RNA的检测的检测RNA的的检检测测采采用用琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，分分为为非非变性电泳和变性电泳。变性电泳和变性电泳。紫紫外外分分光光光光度度法法分分析析所所制制备备RNA的的浓浓度度及及纯度纯度 。1/24/20239RNARNA的提取与电泳的提取与电泳由于由于RNARNA分子是单链核酸分子，它自身可以回折分子是单链核酸分子，它自身可以回折形成局部双链的二级结构及更复杂的分子状态，形成局部双链的

7、二级结构及更复杂的分子状态，所以通过一般传统的琼脂塘凝胶电泳难以得到依所以通过一般传统的琼脂塘凝胶电泳难以得到依赖于分子量的电泳分离条带。赖于分子量的电泳分离条带。为此电泳上样前将样品于为此电泳上样前将样品于6565加热变性加热变性5 5分钟，分钟，使使RNARNA分子的二级结构充分打开，并且在琼脂糖分子的二级结构充分打开，并且在琼脂糖凝胶中加入适量的甲醛，可保证凝胶中加入适量的甲醛，可保证RNARNA分子在电泳分子在电泳过程中持续保持单链状态。过程中持续保持单链状态。如此，总如此，总RANRAN样品便在统一构象下在琼脂糖凝胶样品便在统一构象下在琼脂糖凝胶上得到依赖于分子量的逐级分离条带。上得

8、到依赖于分子量的逐级分离条带。1/24/202310RNARNA的提取与电泳的提取与电泳 可通过紫外分光光度法分析所制备可通过紫外分光光度法分析所制备RNA 的的浓度及纯度浓度及纯度。浓度：浓度：O.D260=1 时，时，RNA 为为 40 g/ml 纯度：纯度：O.D260/O.D280 2.0 1.75 说明存在蛋白质污染说明存在蛋白质污染 2.0 说明存在酚等有机溶液污染说明存在酚等有机溶液污染 1/24/202311RNARNA的提取与电泳的提取与电泳三三.实验方法、步骤和注意事项实验方法、步骤和注意事项兔肝匀浆液兔肝匀浆液0.5ml至至eppendorf中中50l NaAc颠倒混匀颠

9、倒混匀0.5ml酚氯仿异戊醇，混匀酚氯仿异戊醇，混匀置冰浴中置冰浴中20min.离心离心(10000rpm,20min.)吸出水相吸出水相1/24/202312RNARNA的提取与电泳的提取与电泳置置-20冰箱中冰箱中RNA使沉淀使沉淀(1 hr)75乙醇乙醇ml，混匀，混匀离心离心(10000rpm,10min.)溶解之溶解之RNA离心离心(10000rpm,10min.)沉淀沉淀沉淀沉淀50l dH2O(DEPC)加入等体积异丙醇加入等体积异丙醇水相水相(RNA)1/24/202313RNARNA的提取与电泳的提取与电泳 原点原点 28s 18s 5s rRNA1%琼脂糖电泳琼脂糖电泳制胶

10、制胶20l样样品液品液 0，分钟分钟冷至室温冷至室温加加l loading buffer点样点样电泳（电压电泳（电压150V，时间时间 30分钟）分钟）1/24/202314RNARNA的提取与电泳的提取与电泳由于由于RNaseRNase极稳定，所以，在操作极稳定，所以，在操作RNARNA时，要格时，要格外仔细，以防外仔细，以防RNARNA被降解。在提取被降解。在提取RNARNA之前，必之前，必须对所用器皿进行须对所用器皿进行RNaseRNase灭活处理。如用灭活处理。如用180180o oC C干烤干烤8 8小时以上处理玻璃器皿，或用小时以上处理玻璃器皿，或用0.10.1的二的二乙酯焦碳酸乙

11、酯焦碳酸 (DEPC)DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用0.10.1 DEPCDEPC水处理。水处理。注意事项注意事项、抑制内源和外源抑制内源和外源RNase活性活性1/24/202315RNARNA的提取与电泳的提取与电泳 使用使用RNase 抑制剂。细胞内抑制剂。细胞内 RNase 丰富，为丰富，为防止防止RNA 水解，在制备所使用的试剂，异硫水解，在制备所使用的试剂，异硫氰酸胍，酚，氯仿，异戊醇，异丙醇，乙醇，氰酸胍，酚，氯仿，异戊醇，异丙醇，乙醇，DEPC 均为均为RNase 抑制剂。抑

12、制剂。所有器皿均需用含所有器皿均需用含DEPC蒸馏水处理后消毒，蒸馏水处理后消毒，防止细菌防止细菌 RNase 对对RNA 的水解。的水解。潜水电泳槽经潜水电泳槽经 3%H2O2 浸泡浸泡10分钟后用含分钟后用含0.1%DEPC消毒蒸馏水清洗。消毒蒸馏水清洗。带手套操作防止细菌及汗液带手套操作防止细菌及汗液 RNase 对对RNA 水水解。解。1/24/202316RNARNA的提取与电泳的提取与电泳注意：注意：DEPC有致癌之嫌有致癌之嫌，必须小心操，必须小心操 作，防止接触与吸入作，防止接触与吸入！1/24/202317RNARNA的提取与电泳的提取与电泳 2 2、组织新鲜，否则液氮冻后组织新鲜，否则液氮冻后 -70-70 冰箱保存。冰箱保存。3 3、低温：为防止低温：为防止RNA降解降解操作在冰浴或低温操作在冰浴或低温 中进行。中进行。4 4、制备的制备的RNA -70-70 可保存数月。可保存数月。1/24/202318RNARNA的提取与电泳的提取与电泳1/24/202319