【课件】动物细胞工程（第2课时）课件2021-2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、2.2 动物动物细胞工程（细胞工程（课时课时2）教学目标1.阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程，认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。细胞工程人体血液中的树突状细胞是一种具有很强的抗原呈递功能的淋巴细胞。近年来的研究发现，树突状细胞与肿瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，既能表达肿瘤抗原，又能合成激活T细胞的相关刺激分子。用此方法制成的肿瘤疫苗可以诱导机体产生较强的特异性免疫反应，这为癌症的治疗提供了新的方法。u但如何才能让两个不同的细胞融合?u细胞融合技术在生产实践中有哪些应用?新课导入动物细胞融合技术1.概念：2.诱导原理：原理？使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。细胞膜具有一

2、定的流动性动物细胞融合技术3.诱导融合的常用方法：与植物原生质体融合的方法相同物理方法：电融合法、离心法化学方法：聚乙二醇（PEG）融合法生物方法：灭活病毒诱导法动物细胞融合特有1965年，研究证实了灭活的病毒在适当条件下确实可以诱导动物细胞融合。动物细胞融合技术细胞融合的过程两亲本细胞的细胞核逐渐融合病毒吸附在细胞表面并使细胞凝集两亲本细胞膜上磷脂和蛋白质重新排布形成通道通道扩大，病毒流入细胞质灭活的病毒诱导细胞融合的过程示意图病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。【灭活】是指用物理或化学

3、手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病毒的抗原结构。动物细胞融合技术4.动物细胞融合结果：形成单核细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。诱导融合后的细胞一定具有双方的遗传信息吗？为什么？不一定，诱导A、B两种细胞融合，融合后可能有A、B未融合细胞及AA、AB、BB等多种细胞，因此细胞融合后需要进行筛选。动物细胞融合技术动物细胞融合技术5.意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。6.应用：（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径

4、。至今，种间、属间、科间，甚至动植物之间融合都已获得了成功。生物种类细胞来源成功年代酵母菌鸡原生质体血红细胞1975年人胡萝卜腹水癌细胞原生质体1976年人小鼠纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞1978年植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理融合前处理诱导融合的方法意义和用途克服远源杂交的障碍，获得杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性植物细胞的全能性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理（电融合法、离心法）化学（聚乙二醇融合法、高Ca2+-高pH融合法）物理（电融合法）化学（聚乙二醇（PEG）融合法）生物方法：灭活的病毒诱导法制备单克隆抗体动物细胞融合技

5、术1.传统抗体的获得方法（1）分泌细胞 化学本质 分布？浆细胞蛋白质主要分布在血清中，少量分布于组织液和外分泌液中（2）获取方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。（3）缺点：产量低、纯度低、特异性差。血清抗体如何解决？单克隆抗体制备2单克隆抗体的制备思路（1）B淋巴细胞特点：哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的B淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。动物体内产生的特异性抗体种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量单一抗体，必须克隆（大量增殖）单一的B淋巴细胞，形成细胞群。面临面临

6、困难困难：在体外培养条件下，一个：在体外培养条件下，一个B B淋巴细胞淋巴细胞是是不可能不可能无限增殖无限增殖的。的。如何解决这一难题？单克隆抗体制备（2）骨髓瘤细胞特点：在体外培养条件下，在体外培养条件下，能大量能大量增殖增殖。英国：米尔斯坦德国：科勒由于发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。大胆设想一种B淋巴细胞骨髓瘤细胞（能产生抗体）（能大量增殖）融合细胞（既能产生抗体，又能大量增殖）（3）杂交瘤细胞特点：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。单克隆抗体：由单个B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细

7、胞群，由这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。单克隆抗体制备单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程注射特定蛋白免疫小鼠培养小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞骨髓瘤细胞多种细胞多种杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞选择培养基筛选克隆化培养专一抗体检测注射到小鼠腹腔内增殖体外培养单克隆抗体融合单克隆抗体制备用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。用特定的选择培养基进行筛选在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。单克隆抗体制备对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量

8、的能分泌所需抗体的细胞。将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。单克隆抗体制备将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？B-B细胞B-瘤细胞瘤-瘤细胞3种杂交瘤细胞【延伸】若只考虑细胞的两两融合，培养液中共会出现几种细胞？5种融合的细胞3种未融合的细胞2种诱导融合单克隆抗体制备第一次第一次筛选筛选资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径。B淋巴细胞骨髓瘤细

9、胞（A）合成DNAD途径S途径D途径氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合多种杂交细胞既能迅速大量增殖又能产生抗体筛选杂交瘤细胞单克隆抗体制备杂交瘤细胞克隆化培养、抗体检测抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）能产生所需抗体的杂交瘤细胞经多次筛选第二次第二次筛选筛选单克隆抗体制备克隆化培养、抗体检测？多孔细胞培养板96孔板每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不

10、能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。检测原理？抗原抗体杂交技术单克隆抗体制备多孔细胞培养板阳性克隆的筛选和克隆化培养用培养液有限稀释克隆化培养抗体检测单克隆抗体制备抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞能产生所需抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内体外培养单克隆抗体从细胞培养液中提取从小鼠腹水中提取体内培养杂交瘤细胞的特点？既能无限增殖，又能分泌抗体具备两种细胞的遗传物质特异性强，灵敏度高，可大量制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等由于小鼠

11、在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选目的 筛选出？筛选出 的杂交瘤细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞能分泌所需抗体死亡抗体检测生长单克隆抗体制备单克隆抗体制备资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的早早孕诊断试剂盒，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10 d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药

12、物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。用于多种疾病的诊断和病原体鉴定。(1)作为诊断试剂最广泛应用单克隆抗体的应用甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为_免疫小鼠，制备_，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的_会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在_上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。抗原抗AFP单克隆抗体AFP肿瘤(2)用于疾病检测单克隆抗体的应用资料2.使用高效的细

13、胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。(3)用于治疗疾病和运载药物 单克隆抗体的应用特异性强、灵敏度高生物导弹单克隆抗体抗癌药物疗效高、毒副作用小 单克隆抗体的应用课堂小结巩固练习1.判断题（1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞（）（2）单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同（）（3）ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用（）巩固练习2如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述正确的是 （）A是从已免疫的小鼠脾脏中获得的细胞毒性T细胞B中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成C同时具有脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞的特性D是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞D巩固练习3抗体药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列表述正确的是 （）AADC可通过主动运输进入肿瘤细胞B抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡C单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合D肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，所以不会产生新的蛋白质C