【课件】2023届高三生物一轮复习课件:基因工程.pptx
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1、1.限制酶来源?在原核生物中的作用是什么?不破坏自身DNA的原因是什么?作用特点?结果?2.同尾酶概念?同尾酶切割后产生的黏性末端为何能够连接?同尾酶切割后产生的黏性末端通过DNA连接酶连接后,该序列还能再被原来的酶识别和切割吗?3.用同一种限制酶切割后,会出现哪些连接情况?用两种限制酶切割后,会出现哪些连接情况?用不同的限制酶切割的目的?4.基因表达载体的构建时基因表达载体的构建时选择选择限制限制酶的原则酶的原则1 1 1.DNA1.DNA连接酶的作用?类型及特点?连接酶的作用?类型及特点?2.2.载体的种类?各自的用途?作为载体必备的条件?质粒的概念?载体的种类?各自的用途?作为载体必备的
2、条件?质粒的概念?3.3.DNADNA的粗提取与鉴定实验原理?过滤的方法?过滤后取上清液还是取沉淀的粗提取与鉴定实验原理?过滤的方法?过滤后取上清液还是取沉淀物?析出的操作步骤?物?析出的操作步骤?2 2 1.1.基因工程的基本操作程序?基因工程操作环境?基因工程的基本操作程序?基因工程操作环境?操作水平操作水平?原理原理?2.2.目的基因的筛选与获取方法?目的基因的筛选与获取方法?3.3.逆转录法的过程?逆转录法的过程?4.4.基因组文库与基因组文库与cDNAcDNA文库的区别文库的区别(3 3 1.1.PCRPCR原理?条件?原理?条件?缓冲溶液中添加缓冲溶液中添加Mg2+Mg2+的作用的
3、作用?过程?过程?鉴定鉴定PCRPCR产物的方产物的方法?用法?用PCRPCR可以扩增可以扩增mRNAmRNA吗?吗?2.2.引物的引物的作用?作用?要求?为何需要为何需要2 2种引物?扩增种引物?扩增n n次需要多少个引物?次需要多少个引物?4 4 当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时:当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时:1.1.若无法获得该蛋白若无法获得该蛋白,原因可能是什么,原因可能是什么?2.2.以上情况如何解决?以上情况如何解决?3.3.若可以获得该蛋白,但是蛋白质无活性若可以获得该蛋白,但是蛋白质无活性,原因可能是?,原因可能是?4.4.以上情况如何解决?以上情况如何解决
4、?5.5.若若原核生物原核生物由由mRNAmRNA逆转录形成的逆转录形成的cDNAcDNA与原基因的结构相比有哪些不同?与原基因的结构相比有哪些不同?6.6.若若真核生物真核生物由由mRNAmRNA逆转录形成的逆转录形成的cDNAcDNA与原基因的结构相比有哪些不同?与原基因的结构相比有哪些不同?5 5 1.基因表达载体的构建基因表达载体的构建目的?目的?2.2.基因表达载体基因表达载体组成?组成?3.3.基因表达载体基因表达载体各组成部分的作用?各组成部分的作用?4.4.转化的概念?转化的概念?5.5.将目的基因导入受体细胞的方法及适用范围?将目的基因导入受体细胞的方法及适用范围?6 6 1
5、.1.在培养有些转基因植物时,常用农杆菌转化法,在培养有些转基因植物时,常用农杆菌转化法,农杆菌的作用农杆菌的作用是什么是什么?2.2.原理?原理?3.3.采用农杆菌转化法导入目的基因时,为什么目的基因可以整合到染色体的采用农杆菌转化法导入目的基因时,为什么目的基因可以整合到染色体的DNADNA上上?4.4.目的基因插入染色体目的基因插入染色体DNADNA上的目的上的目的是什么?是什么?5.5.两次拼接、两次导入两次拼接、两次导入6.6.转基因的植物细胞如何获得最终的新品种?转基因的植物细胞如何获得最终的新品种?7 7 1 1、检测与鉴定目的基因的目的:、检测与鉴定目的基因的目的:2 2、检测
6、与鉴定的方法:、检测与鉴定的方法:3 3、PCRPCR技术检测基本原理?技术检测基本原理?4 4、核酸分子杂交技术原理?核酸分子杂交技术原理?8 8 1.1.乳腺生物反应器制备流程?乳腺生物反应器制备流程?2.2.为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起?重组在一起?3 3.药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中?药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中?4 4.生物反应器除了用乳腺,还可以用什么器官?生物反应器除了用乳腺,还可以用什么器官?5 5.膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器?膀胱生物反应
7、器哪些方面优于乳腺生物反应器?6 6.研制膀胱生物反应器时,应如何处理目的基因研制膀胱生物反应器时,应如何处理目的基因*?7 7.用生物反应器生产药物的优点?用生物反应器生产药物的优点?8.8.转基因技术中会形成新物种吗?转基因技术中会形成新物种吗?9 9.乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗?9 9 1.乳腺(房)生物反应器与基因工程菌生产药物2.为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题?3.利用转基因技术对猪的器官进行改造,培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官,采用什么方法?4.相比从天然产物中提取
8、的酶,构建基因工程菌,然后用发酵技术生产酶,优势?1010 1.1.工程菌工程菌概念概念2.2.用大肠杆菌生产人胰岛素的流程:用大肠杆菌生产人胰岛素的流程:3.3.目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素,还可以用酵母菌来生产目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素,还可以用酵母菌来生产人胰岛素,请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑,二者生产的人人胰岛素,请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑,二者生产的人胰岛素有何不同?胰岛素有何不同?4.4.蛋白质工程概念?地位?崛起的缘由蛋白质工程概念?地位?崛起的缘由/1111 基因工程是指按照人们的愿望,通过基因工程是指按照人们的愿望,通过转基转基因等技术因等
9、技术,赋予生物,赋予生物新的遗传特性新的遗传特性,创造出,创造出更符合人们需要的更符合人们需要的新的生物类型和生物制品新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看,由于基因工程是在从技术操作层面看,由于基因工程是在DNADNA分分子水平子水平上进行设计和施工的,因此又叫上进行设计和施工的,因此又叫重组重组DNADNA技术技术。一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”1.1.简称:简称:限制酶限制酶2.2.来源:来源:主要是从主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来的。中分离纯化出来的。3.3.作用:作用:识别双链识别双链DNADNA分子的分子的特定特定核苷酸序列核苷酸序列,并
10、且,并且使每一条链中使每一条链中特定部位特定部位的的磷酸二磷酸二酯酯键键断开断开。4.4.作用部位:作用部位:特定部位的磷酸二酯键特定部位的磷酸二酯键ATCGTAGC5353磷磷酸酸二二酯酯键键5.5.识别序列:识别序列:大多数限制酶的大多数限制酶的识别序列识别序列由由6 6个核苷酸个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由组成,也有少数限制酶的识别序列由4 4个个、8 8个个或或其他数量其他数量的核苷酸组成。的核苷酸组成。EcoREcoR5 5G-A-A-T-T-CG-A-A-T-T-C3 33 3C-T-T-A-A-G5C-T-T-A-A-G5SmaSma5 5C-C-C-G-G-GC-C-
11、C-G-G-G3 33 3G-G-G-C-C-C5G-G-G-C-C-C5具有专一性6.切割结果:切口有两种:黏性末端和平末端无论是无论是6 6个碱基还是个碱基还是4 4个碱基,都可以找到一条中心轴线,中轴线个碱基,都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链两侧的双链DNADNA上的碱基是上的碱基是反向对称重复排列的反向对称重复排列的 ,这就是回文序列。这就是回文序列。能能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列回文序列:在切割:在切割部位,一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致部位,一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
12、当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的_将将DNADNA分子的两条链分别切开分子的两条链分别切开时,产生的是时,产生的是_;当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的_切开时,产生的是切开时,产生的是_;中轴线两侧中轴线两侧黏性末端黏性末端中轴线处中轴线处平末端平末端你能根据所掌握的知识,推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗?你能根据所掌握的知识,推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗?原核生物容易受到自然界原核生物容易受到自然界外源外源DNADNA的入侵的入侵,所以它在,所以它在长期的进化长期的进化过程中形成了一套完善的过程中形成了一套完善的防御机制防御机制。限制酶就是
13、它的一种防御性工具。当外源限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNADNA入侵时,它会利用限制酶来入侵时,它会利用限制酶来切割外源切割外源DNADNA,使之失效使之失效,以,以保证自身安全保证自身安全。所以,简单来说:限制酶在原核生物中起到的作用为:所以,简单来说:限制酶在原核生物中起到的作用为:切割外源切割外源DNADNA、使之失效,以保证自身安全、使之失效,以保证自身安全试推测限制酶为什么不会切割自身的试推测限制酶为什么不会切割自身的DNADNA?DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶的识别切割序列不具备这种限制酶的识别切割序列或或DNADNA分子被分子被修饰修饰(甲基化甲基化),使限制
14、酶不能将其切开),使限制酶不能将其切开限制酶切割目的基因片段时需要切割几次?产生几个末端?断开几个磷酸二酯键?限制酶切割目的基因片段时需要切割几次?产生几个末端?断开几个磷酸二酯键?2 4 42 4 44.4.结果:结果:产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端 6.6.单酶切:单酶切:容易出现反连和载体、目的基因的自连现象(即所谓环化)容易出现反连和载体、目的基因的自连现象(即所谓环化)双酶切:双酶切:不同的酶作用于不同的碱基序列,得到不同的黏性末端,避免自身环化和反向连接不同的酶作用于不同的碱基序列,得到不同的黏性末端,避免自身环化和反向连接同尾酶:同尾酶:识别的靶序列不同,但是酶切后形成
15、的粘性末端相同,可通过识别的靶序列不同,但是酶切后形成的粘性末端相同,可通过DNADNA连接酶连接,但一般不能连接酶连接,但一般不能再被原来的酶识别和切割再被原来的酶识别和切割1和2为同尾酶,黏性末端均为GATC,1可以切割的位点,2都可以切割9.9.用同一种限制酶切割后,会出现哪些连接情况?用同一种限制酶切割后,会出现哪些连接情况?目的基因目的基因目的基因目的基因、目的基因自身环化、目的基因自身环化、质粒质粒质粒质粒、质粒质粒自身环化、自身环化、目的基因目的基因质粒质粒、目的基因目的基因质粒质粒反向连接反向连接1010.用两种限制酶切割后,会出现哪些连接情况?用两种限制酶切割后,会出现哪些连
16、接情况?目的基因目的基因目的基因、质粒目的基因、质粒质粒、目的基因质粒、目的基因质粒质粒11.11.用不同的限制酶切割:可以用不同的限制酶切割:可以防止防止目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接(或(或保证保证目的基因和质粒正确连接)目的基因和质粒正确连接)【思考】【思考】用限制酶切割时需注意的事项用限制酶切割时需注意的事项(1)(1)获取目的基因和切割载体时获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶通常使用同种限制酶,目的是目的是 。但是使用该法缺点是容易发生。但是使用该法缺点是容易发生 ,为了避免上,为了避免上述情况发
17、生,可采取的措施是述情况发生,可采取的措施是 。(2)(2)获取一个目的基因需限制酶切割获取一个目的基因需限制酶切割 次次,共产生共产生 个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。为了产生相同的黏性末端,便于连接两4分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接两种两种同尾酶同尾酶切割的切割的DNADNA片段连接后,原来的酶切位点将不存在,不能再被原来的限制酶识别片段连接后,原来的酶切位点将不存在,不能再被原来的限制酶识别不同限制酶不同限制酶切割形成的黏性末端,切割形成的黏性末端,如果互补如果互补则可以相互重新配对连接则可以相互重新配对连接二、二、DNAD
18、NA连接酶连接酶1.1.作用:作用:将两个将两个DNADNA片段片段连接起来,连接起来,恢复恢复被限制酶切开的被限制酶切开的磷酸二酯键磷酸二酯键。2.2.分类:分类:三、载体三、载体 1.1.载体载体的种类的种类:质粒(最常用)、噬菌体、动植物病毒质粒(最常用)、噬菌体、动植物病毒 2.2.载体的作用:载体的作用:将目的基因送入受体细胞将目的基因送入受体细胞3.3.质质粒粒:一一种种裸裸露露的的、结结构构简简单单、独独立立于于真真核核细细胞胞细细胞胞核核或或原原核核细细胞胞拟拟核核DNADNA之之外外,并并具具有有自自我我复复制制能能力力的的的的双链环状双链环状DNADNA分子分子4.4.作为
19、载体作为载体必须具备的条件必须具备的条件:5.5.真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行人工改造人工改造的。的。能在受体细胞中自我复制,或整合到受体能在受体细胞中自我复制,或整合到受体DNADNA上,随受体上,随受体DNADNA同步复制同步复制具有一个至多个限制酶切割位点,供外源具有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNADNA片段(目的基因)插入。片段(目的基因)插入。具有标记基因,便于重组具有标记基因,便于重组DNADNA分子的筛选分子的筛选 对受体细胞无害。对受体细胞无害。E.coliDNAE.coliDNA连接酶连接酶:来源于大肠
20、杆菌;:来源于大肠杆菌;只能连接具有互补只能连接具有互补黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端的的DNADNA片段片段T4DNAT4DNA连接酶连接酶:来源于来源于T4T4噬菌体;噬菌体;既既能连接双链能连接双链DNADNA片段互补的黏性末端,片段互补的黏性末端,又又能连接双链能连接双链 DNADNA片段的平末端片段的平末端(但连接平末端的效率较低)(但连接平末端的效率较低)实验实验DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、实验原理:一、实验原理:1.DNA1.DNA不溶于酒精,蛋白质溶于酒精不溶于酒精,蛋白质溶于酒精2.DNA2.DNA在不同浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶液中的溶解度不同,
21、溶于溶液中的溶解度不同,溶于2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶液3.3.鉴定原理:鉴定原理:DNADNA遇二苯胺试剂呈现蓝色遇二苯胺试剂呈现蓝色二、过程:二、过程:DNADNA含量相对含量相对较高较高的生物组的生物组织,如织,如新鲜洋新鲜洋葱葱、香蕉、菠、香蕉、菠菜、菜花和猪菜、菜花和猪肝等肝等动物细胞(鸡动物细胞(鸡血细胞)血细胞)/植植物细胞物细胞 哺乳哺乳动物成熟的红动物成熟的红细胞?细胞?加加体积相等体积相等、预冷预冷酒精酒精(体积分数体积分数95%95%)静置,得静置,得白色丝状物白色丝状物提取方案:提取方案:用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面用玻璃
22、棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水的水离心将离心将沉淀物沉淀物晾干晾干方案:方案:4 4冰箱静置后取冰箱静置后取上清液上清液离心后取上清液离心后取上清液2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液,溶液,2只试管二苯胺二苯胺沸水浴加热沸水浴加热蓝色蓝色动物细胞的破碎较动物细胞的破碎较易,以鸡血为例,易,以鸡血为例,在鸡血细胞液中加在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,同时用玻璃棒搅拌,吸水胀破后,过滤吸水胀破后,过滤收集滤液即可。收集滤液即可。不能选择不能选择哺乳动哺乳动物成熟的红细胞物成熟的红细胞,因为哺乳动物成因为哺乳动物成熟的红细胞中熟
23、的红细胞中没没有细胞核和线粒有细胞核和线粒体体,几乎,几乎不含不含DNADNA破碎细胞,使核物破碎细胞,使核物质容易溶解在研磨质容易溶解在研磨液中。液中。研磨不充分会使研磨不充分会使细细胞核内的胞核内的DNADNA释放释放不完全,提取的不完全,提取的DNADNA量变少量变少,影响,影响实验结果,导致看实验结果,导致看不到丝状沉淀物、不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显用二苯胺鉴定不显示蓝色等。示蓝色等。研磨液:洗涤剂是一些离子洗涤剂是一些离子去污剂,能去污剂,能溶解细溶解细胞膜,有利于胞膜,有利于DNADNA的释放;的释放;食盐的主要成分是食盐的主要成分是NaClNaCl,有利于有利于DNADNA
24、的溶解。的溶解。上清液中除上清液中除DNADNA之外,之外,可能含有哪些杂质可能含有哪些杂质?低温放置几分钟的作用?低温放置几分钟的作用?搅拌时应搅拌时应轻缓、并沿一个方向的原因?轻缓、并沿一个方向的原因?抑制核酸水解酶的活性,进而抑制抑制核酸水解酶的活性,进而抑制DNADNA降解;抑制降解;抑制DNADNA分子运分子运动,使动,使DNADNA易形成沉淀析出;易形成沉淀析出;低温有利于增加低温有利于增加DNADNA分子柔韧性,分子柔韧性,减少断裂。减少断裂。减少减少DNADNA断裂,断裂,以便获得较完整的以便获得较完整的DNADNA分子分子1.1.基因工程的基本操作程序?基因工程的基本操作程序
25、?P76P76四步四步2.2.基因工程操作环境:基因工程操作环境:体外体外;操作水平:操作水平:DNADNA分子水平分子水平;原理:原理:基因重组基因重组;5.Bt5.Bt基因(基因(BtBt抗虫蛋白基因)表达出的抗虫蛋白基因)表达出的BtBt抗虫蛋白:抗虫蛋白:P77P77右上角右上角杀杀杀杀死死死死害害害害虫虫虫虫的的的的原原原原理理理理?BtBt抗抗虫虫蛋蛋白白被被分分解解为为多多肽肽,多多肽肽与与害害虫虫肠肠上上皮皮细细胞胞的的特特异异性性受受体体结结合合,导导致致细细胞胞膜膜穿穿孔孔,造成害虫死亡造成害虫死亡。不不不不会会会会对对对对人人人人畜畜畜畜有有有有害害害害的的的的原原原原理
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