【公开课】高三生物一轮复习课件：微生物的培养技术及应用.pptx

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1、一轮复习 微生物的培养技术与应用一、微生物的基本培养技术发酵工程的重要基础防止杂菌污染获得纯净的微生物培养物实验室培养微生物的条件为人们需要的微生物提供合适的营养确保其他微生物无法混入为人们需要的微生物提供合适的环境条件将需要的微生物分离出来培养基无菌技术分离技术培养环境1.培养基的配制培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。培养基作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。按物理性质划分：按化学成分划分：按用途划分：培养基类型：固体培养基液体培养基天然培养基 合成培养基鉴别培养基选择培养基培养微生物后液体培养基：固体培养基：培养基类型：分离、计

2、数、鉴定、菌种保存等有无凝固剂如琼脂 微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长形成肉眼可见的菌落用于扩大微生物种群数量培养基种类特点用途物理性质化学成分用途不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、分类鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基天然培养基合成培养基鉴别培养基培养基的基本成分：水碳 源无机碳源：有机碳

3、源：CO2、CO32-、HCO3-。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。自养微生物异养微生物构成细胞物质和一些代谢产物说明微生物的同化作用类型作用：碳 源无机盐氮 源凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质牛肉膏、蛋白胨：培养基的基本成分：无机盐氮 源NH4、NO3-、NH3等。牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。无机氮源：有机氮源：Zn、Cu、Mn、Co、Mo等大量元素：微量元素：Ca、K、Mg等为什么培养基需要氮源？是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的其他条件生长因子常见的生长因子：作用：微生物生长不可缺少的微量有机物。酶和核酸的组成成分。维生素、氨基酸、嘌

4、呤、嘧啶等。一般情况下，不添加氮源培养基可用来培养_微生物固氮 含C、H、O、N有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源，因此可以根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。氮源主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等。无机氮源不但能给自养型微生物提供氮源，也能作为能源物质，如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，提供无机营养，有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）。水的功能：良好的

5、溶剂，维持生物大分子结构的稳定。其他条件还需满足还需满足不同微生物不同微生物生长对生长对pH、氧气及特殊营养物质的要求、氧气及特殊营养物质的要求培养的微生物培养的微生物需要满足的其他要求需要满足的其他要求乳酸杆菌乳酸杆菌培养基中培养基中添加添加维生素维生素霉菌霉菌将将pHpH调调至至酸性酸性细菌细菌将将pHpH调调至至中性或微碱性中性或微碱性厌氧微生物厌氧微生物需要需要提供提供无氧无氧条件条件表表1-1 1000ml牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨培养基的培养基的营养养组成成组分组分含量含量牛肉膏牛肉膏5g5g蛋白胨蛋白胨10g10gNaClNaCl5g5gH2OH2O定容至定容至1000ml1000m

6、l提供的主要营养提供的主要营养碳源、磷酸盐和维生素等碳源、磷酸盐和维生素等氮源和维生素等氮源和维生素等无机盐无机盐水水请判断下列说法的正确性1.同一种物质不能既做碳源，有做氮源。（）2.碳源都能提供能量。（）3.NA2CO3只能提供碳源。（）4.除水以外的无机物只能提供无机盐。（）5.无机氮源也能提供能量。（）二、无菌技术泛指在培养微生物的操作中，避免杂菌污染的方法。获得纯净培养物关键是防止外来杂菌的入侵主要包括_ _和_ _。消毒灭菌 问题：无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？还能有效避免操作者被微生物感染。（1）对实验操作的_、操作者的_，进行清洁和消毒。

7、（2）将用于微生物培养的_、_和_等进行灭菌。空间衣着和手器皿接种用具培养基关于培养基的配制说法不正确的是()A在配制培养乳酸杆菌的培养基时，需加入维生素B微生物的适应性强，配制培养基时可以不考虑pHC虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有碳源、氮源、水和无机盐D配制培养基时要注意各种养分的浓度和比例2幽门螺杆菌(能产生脲酶)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素，严重者则发展为胃癌。我国的共餐制是导致幽门螺杆菌高发的重要原因。在患者体内采集样本并制成菌液后进行培养。下列叙述正确的是()A对幽门螺杆菌进行分离和计数可用平板划线法B分离纯化幽门螺杆菌时应使用以尿素为唯一氮源的培养基C进行

8、幽门螺杆菌培养需要提供95%空气和5%CO2、高湿度的环境D培养基中的营养物质浓度越高，对幽门螺杆菌的生长越有利1.培养基的配制原则(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。(3)pH要适宜：培养不同微生物所需的pH不同。2培养基中营养物质的确定方法不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。如：(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分

9、异养型微生物也可以利用无机氮源。消 毒 指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死 物体或内部一部分微生物。（1）概念：（2）常用的消毒方法100100煮沸煮沸5 56min6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂消毒法化学药剂消毒法紫外线消毒法紫外线消毒法62626565下消毒下消毒30 min30 min或或80809090处理处理30s30s1min1min适合一些适合一些不耐高温的液体不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分的绝大多数微生物

10、，并且不破坏牛奶的营养成分。用用70%70%酒精擦拭双手酒精擦拭双手、用、用氯气消毒水源氯气消毒水源等。等。接种室、接种箱或超净工作台在使用前可接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用紫外线用紫外线照照30min30min。可杀死物体表面和空气中的微生物。在照射前，。可杀死物体表面和空气中的微生物。在照射前，适量喷洒适量喷洒石碳酸石碳酸或或煤酚皂溶液煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。等消毒液，可以加强消毒效果。灭 菌（1）概念：指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。（2）常用的灭菌方法湿热灭菌干热灭菌灼烧灭菌芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的一个园或椭圆形

11、、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠构造。芽孢萌发可形成细菌体。孢子:脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞。它是有丝分裂或减数分裂的产物。湿热灭菌利用利用沸水沸水流通蒸汽流通蒸汽高压蒸汽高压蒸汽高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌效果最好效果最好100KPa100KPa12112115-30min15-30min工具为工具为高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅，常用于培养基、无菌水等的灭菌，常用于培养基、无菌水等的灭菌。注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。干热灭菌将灭菌物品放入密闭将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，容器如干热灭菌箱，在在16

12、0160170170的热的热空气中维持空气中维持2 23h3h。耐高温，需保持干燥的物品，适用于 玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌灼烧灭菌将灭菌对象直接在将灭菌对象直接在酒精灯火焰的充分酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，燃烧层灼烧，使微使微生物燃烧，生物燃烧，可以迅可以迅速地彻底地灭菌。速地彻底地灭菌。灭菌对象：灭菌对象：适用于微生物的适用于微生物的接种工具接种工具，如涂，如涂布器、接种环、接种针或其它布器、接种环、接种针或其它金属用具金属用具，试，试管口、瓶口等管口、瓶口等容易被污染的部位容易被污染的部位类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀

13、死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100 煮沸56 min巴氏消毒法不耐高温的液体6265 煮30 min或80-90 煮30s-1 min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30 min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160170 加热23h湿热灭菌培养基高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121,1530 min接种室、接种箱，超净工作台三、微生物的纯培养培

14、养物培养物纯培养物纯培养物纯培养纯培养将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。由单一个体繁殖所获得的微生物群体获得纯获得纯培养物培养物的过程的过程配制培养基灭菌接种分离培养微生物群微生物群分散分散或或稀释稀释单个细胞单个细胞单个菌落单个菌落繁殖繁殖菌落1.概念：2.特征：分散的微生物(单一个体)在适宜的 表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的 。固体培养基固体培养基子细胞群子细胞群体体形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。是鉴定菌种的重要依据3.获得单菌落的方法：平板划线法平板划线法稀释涂布平板稀释涂布平板法法毛霉酵母菌纯培养方法步骤接种分离酵母菌培养酵

15、母菌制备培养基1.制备培养基配制培养基灭菌倒平板配制培养基灭菌（1 1）配制培养基）配制培养基马铃薯200g切成小块加水1000ml，煮沸至马铃薯软烂过滤，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。（2 2）灭菌）灭菌锥形瓶包器材培养基高压蒸汽灭菌 酵母菌培养基包上牛皮纸 转移加棉塞干热灭菌箱内，在160-170灭菌2h。灭菌15-30min用皮筋勒紧高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121的条件下培养皿干热灭菌（3 3）倒平板）倒平板待培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。冷凝后平板为什么倒置拔出锥拔出锥形瓶的棉形瓶的棉塞塞将瓶口将瓶口迅速通过迅

16、速通过火焰火焰用拇指和食指将培养用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（的缝隙，将培养基（101020mL20mL）倒入培养皿，）倒入培养皿，立即盖上皿盖立即盖上皿盖等待培养基冷等待培养基冷却凝固后，将培却凝固后，将培养皿倒转过来放养皿倒转过来放置置2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。将所倒平板放入37的恒温箱中培养12h24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。3.怎么确定所倒平板未被杂菌污

17、染？1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。思考讨论2.接种和分离酵母菌平板划线法 平板划线法是通过接种环接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。单个细胞微生物群单个菌落连续划线分散或稀释生长繁殖平板划线过程灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞试管口通过火焰在火焰附近用接种环蘸取一环菌液试管口通过火焰，并塞上棉塞将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条

18、平行线，盖上皿盖平板划线过程灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。平板划线过程注意：1.不要将最后一次的划线与第一次划线相连。2.划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）3.一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；4.存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌分区划线法12345接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.划线首尾不能相接每次划线前接种环进行灭菌划线后,培养皿倒置培养连续划线法分区划

19、线法1.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。2.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。思考与讨论3.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时

20、菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上原有微生物3.培养酵母菌 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置倒置，放入28左右的恒温培养箱中培养24-28h。作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染思考：1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。2.你是如何记录实验结果的？可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，

21、光泽度是否增加，等等3.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。（2018全国全国，15分分）在在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：免杂菌的污染。回答下列问题：在实验室中，玻璃和金属材质

22、的实验器具在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_（填填“可以可以”或或“不可以不可以”）放放入干热灭菌箱中进行干热灭菌入干热灭菌箱中进行干热灭菌。牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法。与煮沸消毒法相比，这两牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法。与煮沸消毒法相比，这两种方法的种方法的优点是优点是_。密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_。在照射前，适量喷洒在照射前，适量喷洒_，可强化消毒效果。，可强化消毒效果。水厂供应的自来水通常是经过水厂供应的自来水通常是经过_（填填“氯气氯气”“乙醇乙醇”或或“高锰酸钾高锰酸

23、钾”）消毒消毒的。的。某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是相应温度，最可能的原因是_。可以可以在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少破坏破坏DNA结构结构消毒液消毒液氯气氯气未将锅内冷空气排尽未将锅内冷空气排尽在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物，无菌操作是防止杂菌污染的关键，下列相关叙述，错误的是()A煮沸消毒可以杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子B巴氏消毒法消毒牛奶，基本不破坏其中的营养物

24、质C耐高温的、需要保持干燥的物品，可用干热灭菌法进行灭菌D紫外线消毒前，适量喷洒消毒液可以加强消毒效果解析煮沸消毒只可以杀死物体表面或内部的一部分微生物，A错误。下列有关细菌纯化培养的说法，不正确的是()A实验操作者接种前要用70%的酒精棉球擦手消毒B每次划线后接种环要在酒精灯火焰上灼烧灭菌C培养基上的单个菌落都是一个细菌细胞的克隆D菌液梯度稀释后用涂布法接种，得到单菌落便于计数解析无论是平板划线法或稀释涂布平板法，均没有办法保证观察到的一个菌落是由一个细菌细胞繁殖得来的，因此需要后续的纯化分离，C错误。(2020江苏高考)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下

25、列叙述正确的是()A倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整B图中、区的细菌数量均太多，应从区挑取单菌落C该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的D菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色(2021辽宁丹东开学考试)如图为实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作步骤，下列说法不正确的是()A步骤使用的培养基是已经调节过pH并灭菌的培养基B步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行C到的过程中，接种环共灼烧了5次D步骤操作时，不能将第1区和第5区的划线相连考 点 二 微生物的选择培养和计数实例实例：寻找耐高温的DNA聚合酶筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。PC

26、R是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）一、选择培养基热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。根据微生物对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。启示：耐寒微生物石油分解菌被石油污染的土壤冰川冻土层实验室筛选微生物原理：人为提供_的条件（包括_、_和_等），同时_有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长营养温度pH以尿素为唯一氮源的培养基（1）利用营养条件进行选择培养筛选出能分解尿素的细菌分离固氮菌分离自养型微生物不加含碳有机物的无碳培养基不加氮源的无氮培养基（2）在培养基中加

27、入某种化学物质。分离得到酵母菌、霉菌等加入青霉素的培养基分离得到金黄色葡萄球菌加入高浓度食盐的培养基（3）改变微生物的培养条件。厌氧型微生物，兼性厌氧型无氧环境下培养培养基中加培养基中加氨苄青霉素氨苄青霉素具有具有氨氨苄青霉苄青霉素抗性素抗性的菌落的菌落没有没有氨氨苄青霉苄青霉素抗性素抗性的的细菌细菌培养基应培养基应有菌落有菌落没有没有氨苄青霉素抗氨苄青霉素抗性性的的细菌细菌被淘汰被淘汰怎样怎样选择选择出出抗氨苄青霉素能力抗氨苄青霉素能力的细菌的细菌?实例实例实例实例;选择培养基的概念 在微生物学中，将允许 生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。特定种类的微生物抑制阻止思考

28、怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基 作为对照基础培养基选择培养基 问题：如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？尿素CO(NH2)2含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的细菌将尿素分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。土壤中的细菌分解尿素是因为他们能合成脲酶。CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2 脲酶选择培养基配方的设计尿素的立体结构尿素的立体结构1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素 的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？设计一种选择培养基,用

29、尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。选择培养基配方的设计1.从物理性质来讲，两者属于_培养基，判断依据是_；该类培养基的主要用途为_。2.从用途上来讲，培养基二属于_培养基，目的是为了获得_。3.两种培养基共有的培养基成分有：_；培养基一的碳源为_，氮源为_；培养基二的碳源为_，氮源为_。培养基一牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml培养基二KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡

30、萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml固体添加了凝固剂琼脂分离、鉴定、计数选择能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素当堂训练稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。（二）微生物的选择培养 如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法-稀释涂布平板法。应采用_；由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行_，然后再将菌液_到制备好的_上；两个基本操作

31、：_和_稀释涂布平板法充分稀释涂布选择培养基梯度稀释涂布平板（二）微生物的选择培养稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml107微量 移液器稀释10倍菌液101土壤土壤10g10g 在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。分别取1ml上清液，加入盛有加入盛有9 9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。取6支试管，分别加入9ml无菌水。样品梯度的稀释灼灼将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，进行涂布。涂涂用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

32、涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。滴滴取0.1ml菌液，滴加到培养基表面 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 浸浸取样涂布平板各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照稀释涂布平板法实验操作放入37恒温箱中培养12d稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照恒温培养箱观察与培养1.培养基的制作是否合格未接种培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基制备合格，否则需要重新制备。2.接种操作是否符合无菌操作如果培养基上生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，符合菌落特点，说明操作是符合无菌操作，如果出现其他菌落，说明未达要求获得单菌落的方法平板划线法稀释涂布平板法 稀释涂布平板法除可以分离微生物外，

33、也常用来统稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目；计样品中活菌的数目；1.稀释涂布平板法（1）原理：当样品的稀释度足够_时，培养基表面生长的一个_，来源于_中的一个_；通过计数平板上的_ _数，就能推测出样品中大约含有多少_；高菌落样品稀释液活菌菌落活菌（2）计数原则选择菌落数为_的平板计数30-300同一稀释度下，应至少对_个平板进行重复计数，然后求出_；3平均值样品的 _ 将直接影响平板上的菌落数目；稀释度微生物的数量测定稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍空白对照空白对照注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为

34、了保证结果准确，一般选择菌落数在 _上进行计数。上进行计数。为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布_作为重复组。（重复实验，减少误差）。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目_ 。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数表示。分析实验结果时，要考虑重复组结果_，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。3030030300的平板的平板至少三个平板低低是否接近因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落不能区分死菌与活菌；个体小的细菌在显微镜下难以观察；原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点：2.显微镜直接计数

35、直接计数法优点：快速直观每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每小格平均细菌数40010000稀释倍数稀释倍数1.实验目的：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌2.实验原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000mlKH2PO4和Na2HPO4的作用是：提供无机盐；调节pH。3

36、.3.研究思路；研究思路；土壤取样制备培养基样品稀释与取样涂布微生物的培养与观察 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表38cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。（1）土壤取样 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。（2）配制培养基选择培养基以尿素为唯一氮源完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用（3）样品的稀释将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。1101 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1

37、mL1102110311041105110611079 mL 无菌水90mL无菌水10g取0.1mL 菌液滴加到培养基表面1107移液枪将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀（4）涂布平板操作细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。每个浓度至少设置4个平板1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏

38、蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基：恒温培养箱（5）微生物的培养与观察培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）。（细菌一般在30-37的温度下培养1-2d）计算公式:M代表稀释倍数C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)每g样品中的菌落数 (CV)M例题.某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为2

39、34，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)()A.2.34108 B.2.34109 C.234 D.23.4 B1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。注意事项主要方法主要方法平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布

40、平板法纯化原理纯化原理通过接种环在琼脂固体培养基通过接种环在琼脂固体培养基的表面的表面_操作操作,将聚集将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（表面。（不能计数不能计数）将菌液进行一系列的将菌液进行一系列的_,_,稀稀释度足够高时释度足够高时,聚集在一起的微生聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。（物将被分散成单个细胞。（可计数可计数）连续划线连续划线梯度稀释梯度稀释主要步骤主要步骤_操作操作接种工具接种工具_平板示平板示意图意图 平板划线平板划线涂布器涂布器两种接种方法的比较两种接种方法的比较梯度稀释和涂布平板操作梯度稀释和涂布平板操作接种环接种环1.结合对照组，分

41、析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。如果没有接种的培养基上如果没有接种的培养基上没有菌落生长没有菌落生长，说明说明培养培养基没有被杂菌污染基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌如果接种后的完全培养基上的菌落数落数明显多于明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基上的菌落数，说明选择培养选择培养基筛选出了一些尿素分解菌基筛选出了一些尿素分解菌。思考2.你是否获得了某一稀释度下菌落数 为30300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？如果得到了两个或多个菌落数为30300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。3.你统计的每克土样

42、中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定进一步探究分解尿素细菌的进一步鉴定 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。分解尿素细菌鉴定原理：细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而

43、判断该菌是否为尿素分解细菌。CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2 脲酶呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。红 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：分解纤维素的细菌鉴定：纤维素能与刚果红形成红色复合物，但纤维素水解产物纤维二糖和葡萄糖不能与刚果红形成红色复合物。在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，接种土壤微生物培养，菌落周围出现透明圈，说明这些细菌能分解纤维素。透明圈透明圈地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产

44、酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。（1）现在从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环

45、境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分用途 复习；培养基的类型及用途工业生产观察微生物的运动、分类鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种工业生产分类、鉴定培养、分离出特定微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基天然培养基合成培养基鉴别培养基 将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水

46、样中大肠杆菌的数量。测定饮水中大肠杆菌数量的方法：滤膜法项目选择培养基鉴别培养基原理用途举例图示尿素尿素分分解菌解菌大肠大肠杆菌杆菌加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物培养酵母菌和霉菌时，可在培养基培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌培养可分解尿素的细菌可用伊红美蓝培养基鉴定饮用

47、可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠水或乳制品中是否含有大肠杆菌杆菌(若有，则菌落呈黑色若有，则菌落呈黑色)选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为()A伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基B含青霉素的培养基、含氨的无机培养基C含氨的无机培养基、含青霉素的培养基D含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基(2021山东等级考)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙

48、两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是()A甲菌属于解脂菌B实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源C可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比D该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力(2019北北京京高高考考)筛筛选选淀淀粉粉分分解解菌菌需需使使用用以以淀淀粉粉为为唯唯一一碳碳源源的的培培养养基基。接接种种培培养养后后，若若细细菌菌能能分分解解淀淀粉粉，培培养养平平板板经经稀稀碘碘液液处处理理，会会出出现现以以菌菌落落为中心的透明圈为中心的透明圈(如图如图)，实验结果见下表。，实验结果见下表。菌种菌种菌落直径：菌落直径：C(mm)透

49、明圈直径：透明圈直径：H(mm)H/C细菌细菌5.111.22.2细菌细菌8.113.01.6有关本实验的叙述，错误的是有关本实验的叙述，错误的是()A培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质B筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布C以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外DH/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异10(2020全国卷)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤

50、泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。(1)实实验验时时，盛盛有有水水或或培培养养基基的的摇摇瓶瓶通通常常采采用用_的的方方法法进进行行灭灭菌菌。乙乙培培养养基基中中的的Y物物质质是是_。甲甲、乙乙培培养养基基均均属属于于_培养基。培养基。(2)实实验验中中初初步步估估测测摇摇瓶瓶M中中细细菌菌细细胞胞数数为为2107个个/mL，若若要要在在每每个个平平板板上上涂涂布布100 L稀稀释释后后的的菌菌液液，且且保保证证每每个个平平板板上上长长出出的的菌菌落落数数不不超超过过200个，则至少应将摇瓶个，则至少应将