【课件】微生物的培养技术及应用（第二课时）课件-2022-2023学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptx

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1、第一章 发酵工程第2节 微生物的培养技术及应用新人教版 选择性必修三 生物技术与工程尿素的分子模型尿素的分子模型 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。情境导入u筛选原则：聚聚合合酶酶链链式式反反应应（PCRPCR）是是一一种种在在体体外外扩扩增增DNADNA片片段段的的技技术术，此此项项技技术术要要求求使使用用耐耐高高温温的的DNADNA聚聚合合酶酶。19731973年年，科科学学家家布鲁克从从美美国国黄黄石石国国家家公公园园的的热热泉泉中中筛筛选选出出水水生生

2、栖栖热热菌菌（TaqTaq细细菌菌），进进而而提提取取出出耐耐高高温温的的DNADNA聚聚合合酶酶（TaqTaq酶酶）。这这种种酶酶目目前前已已被被广广泛泛用用于于聚聚合酶链式反应（合酶链式反应（PCRPCR）。美国黄石公园的热泉美国黄石公园的热泉情境导入1.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？这是因为水生栖热菌能在7080的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。耐寒微生物耐热微生物石油分解菌冰川冻土层冰川冻土层被石油污染的土壤被石油污染的土壤热泉热泉根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。u筛选原则：实验

3、实中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的人为提供有利于目的菌生长的条件条件，同时抑制或阻止其他种类微生物的抑制或阻止其他种类微生物的生长生长。1.概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基2.举例：一、选择培养基分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离自养型微生物加高浓度食盐金黄色葡萄球菌不加碳源的培养基不加氮源的培养基加入青霉素的培养基尿素CO(NH2)2含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素

4、，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。一、选择培养基CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2 脲酶脲酶3.选择培养基的设计：牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一培养基二讨论：1.从物理性质看两种培养基属于哪类？依据是什么？都属于固体培养基。依据是添加了凝固剂琼脂。2.从用途上来

5、讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？培养基二属于选择培养基；其可获得能分解尿素的微生物。3.两种培养基中共有哪些成分？碳源、氮源、无机盐、水培养基一的碳源为_，氮源为_。培养基二的碳源为_，氮源为_。牛肉膏，蛋白胨葡萄糖尿素一、选择培养基牛肉膏，蛋白胨编号成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量0.4 g4.0 g0.5 g0.5 g100 mL【例1】据某微生物培养基的配方表回答下列问题1.此培养基按物理性质划分属于_培养基，理由是_ 按功能划分属于_培养基，因为没有碳源，只有_微生物才能生长(利用空气中的CO2)。2.此培养基含有的微生物的营养成分包括_三类，若

6、加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括_。3.若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是_。4.若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中 成分(填表中序号)，应加入_和_的有机物。液体选择自养型水、无机盐、氮源碳源、氮源、生长因子凝固剂(琼脂)尿素不含氮元素没有凝固剂(琼脂)习题巩固一、选择培养基选择培养基与鉴别培养基的比较选择培养基与鉴别培养基的比较项目选择培养基鉴别培养基原理用途举例图示加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应培养、分离出目标

7、微生物鉴别目标微生物培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌。可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(菌落呈深紫色)二、微生物的选择培养 如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌（计数），或想得到分解尿素的细菌的纯培养物（分离），仅有选择培养基是不够的，还必须采用稀释涂布平析法。稀释涂布平板法u将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。（1）原理（2）操作流程稀释涂布平板法（2）操作流程铲取土样，将样品装入纸袋中。铲取

8、土样，将样品装入纸袋中。注意：取土样时用的铁铲和样品袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。稀释涂布平板法（2）操作流程 将将10g土样加入盛有土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清上清液加入盛有液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次无菌水的试管中，依次等比稀释等比稀释。1101 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1102110311041105110611079 mL 无菌水无菌水90mL无菌水无菌水10g在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。稀释涂布平板法（2）操作流程微量微量移液器移液器

9、取取0.1mL菌液，滴菌液，滴加到培养基表面。加到培养基表面。将涂布器浸在将涂布器浸在盛有酒精的烧杯盛有酒精的烧杯中。中。将涂布器放在火焰上灼将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。冷却后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀地涂布在培用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。使涂布均匀。待涂布的菌液被_后，将平板_，放入_ 中培养_d，在涂布有_菌液的平板上就可以观察到 分离的_。培养基吸收倒置恒温培养箱12合适浓度单菌落稀释涂布平板法（2）操作流程二、微生物的选择培养（3）注意事项过程中所有操作

10、都应在酒精灯火焰旁进行。涂布器浸在体积分数为75%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中 滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。不要将过热的涂 布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。平板划线法能否对细菌进行计数？为什么？不能灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌；无法确定接种环上含有蘸取了多少菌液。平板划线法最开始的划线菌落会长成一片，导致无法计数；平板划线法稀释涂布平板法关键操作接种工具用途接种效果图在固体培养基的表面连续数次划线将菌液进行一系列的梯度稀释将菌液涂布到固体培养基表面接种环涂布器分离纯化菌种，获得单菌落分离纯化菌种，获得单菌落用于计数2023/3/27小结：两种接种方法的比

11、较统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。原因：_。三、微生物的数量测定原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。选择30-300个菌落的平板进行计数；同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。计数原则:结果分析：少细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落当两个或多个1.稀释涂布平板法菌落数活菌数三、微生物的数量测定1.稀释涂布平板法例题1：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的活菌数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)(

12、)A.2.34108 B.2.34109 C.2340 D.234 B计算公式：每g样品中的活菌数(CV)MpM代表代表稀释倍数稀释倍数pC代表某一稀释度下平板上生长的代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数平均菌落数pV代表涂布平板时所用的代表涂布平板时所用的稀释液的体积稀释液的体积(mL)三、微生物的数量测定计算公式：pM代表代表稀释倍数稀释倍数pC代表某一稀释度下平板上生长的代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数平均菌落数pV代表涂布平板时所用的代表涂布平板时所用的稀释液的体积稀释液的体积(mL)例2:甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均

13、使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+100）/30.1 105=9107个1.稀释涂布平板法每g样品中的活菌数(CV)M【例3】如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。请据图分析，下列说法错误的是()AA.号试管的稀释倍数为103B.号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能为号试管的10倍C.号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7109D.将涂布器在酒精灯火焰上灼烧冷却后，再进行涂布三、微生物的数量测定2.显微镜直接计数法原理：利用特定的_或_在_下观察、计数，然后再计算_的样品中微生物的数量。细菌计数板血细胞计数板显微镜

14、一定体积统计结果一般是活菌数和死菌数的总和，故统计结果比活菌实际数目 _。多结果分析：n血细胞计数板：常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。n细菌计数板：对细菌等较小的细胞进行观察和计数。u优点：快速、直观u缺点：a.不能区分死菌和活菌偏大。b.不适于对运动细菌的计数。c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。提示：区分死菌和活菌。可采用提示：区分死菌和活菌。可采用台盼蓝台盼蓝对细菌进行染色。能被染对细菌进行染色。能被染成成蓝色的则为死菌，不能被染色的则为死菌，不能被染色的则是活菌。在此条件下，计数的则是活菌。在此条件下，计数时，只需计数不被染色的酵母菌。时，只需计数不被染色的酵母菌。三、微

15、生物的数量测定2.显微镜直接计数法血细胞计数板计数室面积1mm2，液体高度0.1mm，所含液体体积为0.1mm3计数室0.1mm0.1mm3=0.110-3cm3=10-4mL每个小方格平均酵母菌数40010-4稀释倍数每毫升原液酵母菌数=细菌计数板计数室面积1mm2，高度是0.02 mm2，所含液体体积为0.02mm3每毫升原液细菌数=每个小方格平均细菌数400210-5稀释倍数0.02mm3=0.0210-3cm3=210-5mL每毫升原液酵母菌数每小格平均酵母菌数每毫升原液酵母菌数每小格平均酵母菌数40010000400100004001000040010000稀释倍稀释倍数数每毫升原液

16、细菌数每小格平均细菌数每毫升原液细菌数每小格平均细菌数40050000400500004005000040050000稀释倍数稀释倍数微生物的计数方法比较内容直接计数法（显微镜计法）间接计数法(稀释涂布平板法）计数依据细菌个数培养基上菌落数计算公式每毫升原液含细菌数每小格平均细菌数40010000稀释倍数每克样品中的细菌数=(CV)MC:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数缺点不能区分死菌与活菌当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落结果比实际值偏大比实际值偏小（或50000）每毫升原液（每克样品）中的细胞数=稀释液的浓度稀释倍

17、数总结：葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。1.培养基的制备配方：常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。思考：能用牛肉膏、蛋白胨作为碳源代替葡萄糖吗？不可以。因含有氮元素。细菌宜在酸碱度细菌宜在酸碱度接近中性接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表地表38cm38cm的土

18、壤层。铲去的土壤层。铲去3cm3cm左右的表层土，取样，将样品装入事先左右的表层土，取样，将样品装入事先准备好的取样纸袋。准备好的取样纸袋。取土样时用的铁铲和取样取土样时用的铁铲和取样袋在使用前袋在使用前都需要灭菌都需要灭菌。操作。操作完成后，一定完成后，一定要洗手要洗手。注意2.实验设计（1）土壤取样 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以便获得菌落数在30300之间的平板。测细菌数：一般用104、105、106稀释液测放线菌：一般用103、104、105稀释液测真菌数：一般用102、103、104稀释液（2）样品的稀释与稀释涂布平板法接种可以将稀释范围放宽一点，将

19、11031107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30300的平板进行计数。在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30300的平板进行计数？思考2.实验设计稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍空白对照空白对照空白对照组：应接种等量的无菌水 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37的温度下培养1-2d。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足

20、而导致遗漏菌落的数目。（3）微生物的培养与观察2.实验设计培养条件：结果：记录：稀释度104105106107123平均值123平均值123平均值123平均值菌落数/平板稀释度104105106123平均值123平均值123平均值菌落数/平板1213 14120 130 140130每克土样中分解尿素的细菌的数目=1.3108(130/0.1)105 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。原理：3.初步鉴定土壤中分解尿素的细菌的鉴定CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2 脲酶脲酶脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红一、

21、概念检测1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。（1）这种培养基是一种选择培养基。（）（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（）（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（）D练习与应用2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（）A.菌落中的细菌数目是固定的B.平板上的一个菌落就是一个细菌C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌二、拓展应用1.反刍（chu)动物，如牛

22、和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。练习与应用用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养创造无氧环境进行培养二、拓展应用2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸杆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这

23、样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。练习与应用二、拓展应用2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸杆等生产酒

24、精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。练习与应用（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。二、拓展应用2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%60%能被土壤中某些

25、微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。练习与应用（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。