【生物】动物细胞融合技术与单克隆抗体课件高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养温故而知新：温故而知新：植物体细胞杂交技术跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出新的作物类型。有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？实例：1970年年 人人-鼠细胞融合融合实验鼠细胞融合融合实验回顾回顾-必修一：细胞膜的结构必修一：细胞膜的结构请同学们快速阅读课本P48页回答以下问题1.什么是动物细胞融合技术（概念）？原理是什么？2.所形成的杂种细胞有什么特点？3.诱导动物细胞融合的方法有哪些？4.动物细胞融合技术的意义和应用有哪些？一、动物细胞融合技术1

2、、概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。4、结果：形成形成杂交细胞。杂交细胞。即融合后形成的原来两个或即融合后形成的原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞多个细胞遗传信息的单核细胞。2、原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性3、诱导方式物理法：离心、振动、电激物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（化学法：聚乙二醇（PEG)PEG)生物法：灭活的病毒生物法：灭活的病毒（动物细胞融合特有）与植物原生质体融合的方法相同仙台病毒仙台病毒仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线紫外线紫外线灭活灭活灭活灭活丧失感染活性（不感染细胞）丧失感染活性（不感染细胞）丧失感

3、染活性（不感染细胞）丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）保留融合活性（诱导细胞融合）保留融合活性（诱导细胞融合）保留融合活性（诱导细胞融合）1、什么是病毒的灭活？灭活是指用物理或化学手段灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。但是并不破坏病毒的抗原结构。病毒表面的病毒表面的糖蛋白糖蛋白和一些和一些酶酶与细胞膜上的糖蛋白发生作与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使用，使细胞互相凝聚细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。2、灭活病

4、毒诱导细胞融合的原理（二）拓展：3、灭活病毒诱导细胞融合过程：4、动物细胞融合技术全过程:正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞5、动物细胞融合实例：动物细胞融合完成的标志？细胞核的融合 意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。动植物之间）成为可能。应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。

5、重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。6 6、细胞融合技术的、细胞融合技术的意义和应用：意义和应用：植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性、植植物细胞的全能性物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散细胞分散成单个细胞成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二电融合法、离心法；聚乙二醇（醇（PEGPEG）融合法、高）融合法、高CaCa2+2+-高高pHpH融合法融合

6、法PEGPEG融合法、电融合法、灭融合法、电融合法、灭活病毒诱导法活病毒诱导法再生出细胞壁再生出细胞壁细胞核的融合细胞核的融合获得完整的杂种植株获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能2023/3/277、动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较【问题2】19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞

7、。诱导 融合传统抗体制备方法及缺陷传统抗体制备方法及缺陷缺陷：缺陷：产量低、纯度低，且抗体的特异性产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。差、灵敏度低。不能无限增殖产生大量抗体不能无限增殖产生大量抗体动物体内动物体内抗原抗原 注射注射浆细胞浆细胞抗体抗体 B B淋巴细胞淋巴细胞增殖增殖分化分化二、单克隆抗体及其应用 ）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上）每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体1、科学家发现：单克 隆抗 体如何获得大量、单一的抗体？体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖2、需解决问题：3、遗憾：如何解决这一难题？二、单克隆抗体及其应用一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞 细胞群细

8、胞群抗体抗体克隆 二、单克隆抗体及其应用由由单个单个B B淋巴细胞淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学化学性质单一、特异性强的抗体性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。称为单克隆抗体。单克隆抗体：单克隆抗体：杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程米尔斯坦米尔斯坦科勒科勒由于发明了单克隆抗体的制备技由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于术，米尔斯坦和科勒于19841984年获年获得了诺贝尔生理学或医学奖得了诺贝尔生理学或医学奖一种一种B B

9、淋巴细胞淋巴细胞（只产生一种特（只产生一种特定抗体）定抗体）能在体外大量增能在体外大量增殖的殖的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞动物细动物细胞融合胞融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细动物细胞培养胞培养大量的特定抗体大量的特定抗体既能迅速大量增殖，既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体又能产生专一抗体二、单克隆抗体及其应用用抗原注射小鼠用抗原注射小鼠从患骨髓瘤的小鼠体内取从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养骨髓瘤细胞的培养已免疫多种已免疫多种B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导融合诱导融合多种杂交细胞多种杂交细胞小鼠的脾脏中获取2、单克隆抗体的制备过程置于置于选择性培养基选择性培养基上培养上培养 2杂交

10、瘤细胞杂交瘤细胞 13第一次筛选第一次筛选多种杂交多种杂交瘤细胞瘤细胞融合的细胞融合的细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞自身融合自身融合B B细胞自身细胞自身融合融合杂交细胞杂交细胞 132未融合的未融合的B B淋巴细胞淋巴细胞未融合的骨未融合的骨髓瘤细胞髓瘤细胞未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。克隆化培养克隆化培养抗体检测抗体检测第二次筛选第二次筛选(抗原抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术)多种杂交瘤细胞多种杂交瘤细胞能分泌能分泌所需所需抗体抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞阳性细胞阳性细胞注射到小鼠体内体外培养分离、提纯单克隆抗体分离、提纯单克隆抗体体内或体外培养

11、能分泌能分泌所需所需抗体抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞细胞培养工程师在工作细胞培养工程师在工作单克隆抗体的制备过程动物细胞融合动物细胞培养给小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴细胞（免疫）骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞单克隆抗体能分泌所需抗体的杂交瘤细胞第一次筛选第二次筛选二、单克隆抗体及其应用诱导融合选择培养基克隆化培养，专一抗体检验体外培养或小鼠腹腔内增殖特异性强灵敏度高可大量制备既能大量繁殖又能产生专一抗体（1 1）第一次筛选的目的第一次筛选的目的_（2 2）如何筛选如何筛选_（3 3）筛选原理筛选原理_（4 4）杂交瘤细胞的特点）杂交瘤细胞的特点_筛选获得杂交瘤细胞筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培

12、养基进行筛选用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长只有融合的杂交瘤细胞才能生长既能迅速大量繁殖，又能产生抗体既能迅速大量繁殖，又能产生抗体二、单克隆抗体及其应用（5 5）第二次筛选的目的第二次筛选的目的_（6 6）如何筛选如何筛选_（7 7）选择抗体检测呈）选择抗体检测呈_性的杂交瘤性的杂交瘤 细胞，即细胞，即_（8 8）抗体检测原理抗体检测原理_获得足够数量的能分泌所需抗体获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞用用9696孔板培养，

13、在每一个孔中尽量只接孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）化培养和抗体检测（进行多次筛选）阳阳分泌的抗体能与特定的抗原结合分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）分子水平的鉴定）二、单克隆抗体及其应用阳性孔阳性孔阳性孔阳性孔补充资料补充资料2：抗体检测抗体检测抗体检测抗体检测的方法的方法的方法的方法抗原抗原抗原抗原-抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法在单克隆抗体制备过程中，在单克隆抗体制备过程中，在单克隆抗体制备过程中，在单克隆抗体制备过程中，

14、两次筛选两次筛选两次筛选两次筛选的的的的目的目的目的目的和和和和方法方法方法方法是是是是不相同不相同不相同不相同的。的。的。的。将杂交瘤细胞群稀释，约将杂交瘤细胞群稀释，约每孔每孔1 1个细个细胞胞进行培养进行培养 （克隆化培养克隆化培养）一段时间后，一段时间后，检测各孔上清液中细检测各孔上清液中细胞分泌的抗体胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔为阳性孔多孔细胞培养板多孔细胞培养板抗体检测板抗体检测板分泌抗体分泌抗体能跟能跟特定抗原特定抗原结合的细胞结合的细胞即为即为所需杂交瘤细胞所需杂交瘤细胞单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用资料资料1 1 用抗人绒

15、毛膜促性腺激用抗人绒毛膜促性腺激素单克素单克隆抗体做成的隆抗体做成的“早早孕诊早早孕诊断试剂盒断试剂盒”。在妊娠第。在妊娠第8 8天就可天就可以作出诊断，这比原来的诊断方以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了法提前了10d10d左右，可以避免孕左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在方法检测的准确率在90%90%以上。以上。资料资料2 2 使用高效的细胞毒素类使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素细胞。但细胞毒素没有特异性，没有特异性，在

16、杀伤肿瘤细胞的同时还会对在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体它在临床上的应用。抗体-药物药物偶联物偶联物（antibody-antibody-drugconjugates,ADCdrugconjugates,ADC）通过将通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADCADC通常由抗体、接头和药物通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素如细胞毒素)三部分组成，它三部分组成，它的作用机制如下图所示。的作用机制如下图所示。

17、抗体抗体药物物接接头ADCADC被被细胞吞噬胞吞噬释放放药药物物溶溶酶体裂解体裂解细细胞胞凋亡凋亡1.1.ADCADC的抗体和药物各具有什么作用？的抗体和药物各具有什么作用？讨论讨论 抗体主要发挥抗体主要发挥靶向运输作用靶向运输作用，即通过，即通过特异性结合靶细胞表面特异性结合靶细胞表面的抗原的抗原，将连接的，将连接的药物输送到靶细胞药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞，如杀伤靶细胞2.2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADCADC偶联的药物？偶联的药物？3.3.单克隆抗体诊断试剂盒和单克隆抗体诊断试剂盒和ADCAD

18、C在临床应用上各具有什么优势？在临床应用上各具有什么优势？可以用可以用放射性同位素放射性同位素标记单克隆抗体进行标记单克隆抗体进行靶向放疗靶向放疗；一些一些作用于细胞信号转导通路的药物作用于细胞信号转导通路的药物可以通过可以通过阻断肿瘤细胞的信阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。进行治疗。单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应单克隆抗体只与特定的抗原反应，因，因此此检测的特异性和灵敏度大大提高检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的生产单克隆抗体

19、的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；ADCADC能够能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用胞的杀伤作用，因此它在临床上具有，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小靶点清楚、毒副作用小等优点等优点单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用（1 1）作为诊断试剂）作为诊断试剂最广泛的应用最广泛的应用优点：优点：血型检测试剂血型检测试剂方法：方法：方法：方法：抗原抗原抗原抗原-抗体杂交法抗体杂交法

20、抗体杂交法抗体杂交法准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速抗抗抗抗人绒毛促性腺激素人绒毛促性腺激素人绒毛促性腺激素人绒毛促性腺激素单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体比原来诊断方法提前了比原来诊断方法提前了比原来诊断方法提前了比原来诊断方法提前了10d10d10d10d左右，左右，左右，左右，准确率在准确率在准确率在准确率在90909090以上。以上。以上。以上。（2 2）用于治疗疾病和运载药物）用于治疗疾病和运载药物如：制成如：制成“生物导弹生物导弹”“生物导弹”单克隆抗体药物注意注意：“生物导弹生物导弹”单抗导向单抗导向，药物为，药物为弹头弹头优点：位置准确、疗效高、副作用小结合

21、同位素的单抗一、概念检测1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株练习与应用C2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体A练习与应用练习与应用拓展应用 1.提示：可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,日前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。