弓形虫基因工程疫苗研究进展.docx

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1、弓形虫基因工程疫苗研究进展摘要：弓形虫病是严重危害人和动物健康的重要人畜共患病。疫苗接种是目前防控弓形虫病的主要手段。根据国内外弓形虫病研究的现状，简要介绍了弓形虫基因结构、主要编码蛋白和相关基因工程疫苗的最新研究进展，主要包括核酸疫苗、重组卡介苗、多肽疫苗、基因缺失苗等，最后对基因工程疫苗研究工作的继续开展提出了建议。关键词：弓形虫；基因；抗原蛋白；基因工程疫苗1基因组结构弓形虫DNA以线粒体DNA、染色体DNA和类质共生体DNA三种形式存在。线粒体DNA为环形，长度为36kb。有一段约10kb的颠倒重复序列。它除了编码与呼吸链相关蛋白外，还有可能参与编码弓形虫期转换的有关物质4。染色体DN

2、A中G+C含量约为55%，没有甲基化的碱基5。类质共生体DNA也为环形，大小35kb，是以其他真核生物类质体DNA序列为探针，通过原位杂交而发现的序列6。研究发现，类质共生体有绿藻原性，在漫长的进化过程中才逐渐演变成细胞器，它可能编码DNA依赖的RNA聚合酶亚单位和核糖体RNA小亚单位7。2主要编码蛋白与基因工程疫苗2.1P30蛋白抗原P30基因为单一拷贝基因，全长1634bp，不含有内含子。P30突变导致虫体结合细胞能力显著下降，在黏附宿主细胞膜过程中起着配体作用，在原核、真核和昆虫细胞中均能表达出融合和非融合形式的重组蛋白8。P30表达产物的抗原活性与蛋白分子的折叠存在密切相关9，分子构象

3、高度决定其抗原性。易艳军10构建了弓形虫P30基因的乳酸乳球菌表达质粒L2P-P30-T，并在乳酸乳球菌中表达P30基因，表达产物口服免疫小鼠，结果表明在体液免疫、黏膜免疫水平上诱导小鼠对弓形虫感染具有保护力。魏庆宽等11扩增HBAg目的基因片段，并将HBAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表达载体中，构建了pcDNA3-HBAg-p30-ROP2多基因真核表达载体，该载体包含了p30-ROP2和HBAg目的基因的完整序列，为进一步研究多基因核酸疫苗奠定了基础。2.2P22蛋白抗原P22蛋白抗原是第2個被克隆和测序的弓形虫表面抗原。速殖子入侵的过程由P22介导，锚定于有核细胞表面，

4、并进入有核细胞内部12。抗P22蛋白抗体可以阻断弓形虫的再定位。P22蛋白除介导弓形虫速殖子的入侵过程外，在弓形虫速殖子向缓殖子转化的过程中发挥作用。赵东岳等13将去掉信号肽和C-末端的基因片段插入原核表达载体pGE某-4T-3后转化到大肠杆菌DH5，采用诱导进行可溶性表达。重组蛋白具有良好的完全抗原活性，这也为弓形虫的基因重组疫苗研究奠定了基础。全娟花等14将弓形虫SAG2基因插入pCMV-Taq2B载体，使其在真核细胞中高水平稳定表达，构建含pCMV-Taq2B-Surfaceantigen2（表面膜抗原2）成分的核酸疫苗，结果表明，免疫组能产生特异性IgG抗体，末次免疫后28d达到峰值。

5、2.3P43蛋白抗原P43蛋白抗原存在于弓形虫所有入侵阶段的膜蛋白。未成熟的P43蛋白由385个氨基酸残基组成，含有一个N端信号肽和GPI。P43蛋白是参与弓形虫入侵宿主细胞过程的主要分子，介导对宿主细胞的识别和黏附15。朱刚16以RH株弓形虫P43蛋白为抗原分子，构建了重组质粒，并以兔抗P43蛋白血清检测到该基因所表达蛋白具有免疫原性。对小鼠肌注后，检测小鼠产生了细胞免疫和体液免疫应答，此DNA疫苗对小鼠感染弓形虫具有一定的免疫保护。2.4P35蛋白抗原张仁利等17成功地进行了弓形虫P35蛋白的基因克隆，对P35蛋白进行分析，发现其C端区有高亲水性区域在201225和301340氨基酸处，同

6、时也发现其编码的氨基酸序列含有多个T、B细胞的表位，P35蛋白可以产生部分的免疫保护力。易俊波等18则采用弓形虫RH株表面抗原P35的cDNA序列设计一对引物，扩增出P35的基因片段，并将其克隆到T载体中。亚克隆至原核表达载体pET-KDO后，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达，得到了具有良好抗原性的重组P35融合蛋白。2.5P23蛋白抗原P23抗原为毒力相关抗原，位于速殖子表膜。该抗原仅见于RH株和BK株等强毒株，临床分离的弱毒株未发现19。研究人员在研究弓形虫疫苗的过程中发现了一种24ku的多肽，该多肽能产生一定的免疫保护性，能阻止弓形虫速殖子入侵宿主细胞。该多肽基因表达产物能在动物体内产生抗

7、P23抗体，表明P23蛋白可能包含有该多肽的免疫表位。P23蛋白有望成为研发新型基因工程疫苗的重要抗原。2.6棒状体蛋白2.6.1棒状体蛋白1棒状体蛋白1基因是一个单拷贝基因，全长约为2.1kb，蛋白分子质量约60.5kDa，其N端为富含脯氨酸的酸性结构域，后面则是碱性羧基末端区域。用抗棒状体蛋白1基因的单抗处理后，弓形虫对宿主细胞的黏附受到抑制。棒状体蛋白1基因尽管能诱导机体系统和黏膜局部体液免疫应答，但并不能产生明显的免疫保护20。2.6.2棒狀体蛋白2棒状体蛋白2是弓形虫棒状体分泌的另一个重要蛋白，基因全长2234bp，不含内含子，未成熟的前体蛋白约66kDa，成熟的棒状体蛋白2约为54

8、kDa。该蛋白参与弓形虫侵入后纳虫泡膜的形成，在弓形虫生活史的速殖子期、缓殖子期以及子孢子期均有表达。研究发现棒状体蛋白2的氨基端存在一系列的两亲性螺旋，单一的螺旋就能黏附于细胞膜上，共同作用则优先黏附于新形成的纳虫泡膜。肖婷等21构建了pEGFP-N1-HBAg-p30-ROP2真核表达载体，然后转染293T细胞并正确表达融合蛋白，该融合蛋白能被弓形虫P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别，具有免疫反应性，为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了良好基础。2.7微线体蛋白2.7.1微线体蛋白2（MIC2）微线体蛋白2基因是单拷贝基因，有3个内含子，全长2307bp，编码含769个氨基酸

9、残基，且698718位氨基酸残基间存在一个短的疏水信号肽，为典型的跨膜区。TgMIC2在虫体的各期均有表达，TgMIC2和TgM2AP以11的比例形成一个包含3个aB二聚体六聚体复合体。郑斌等22采用定点突变技术，准确找到了MIC2与醛缩酶的作用位点为色氨酸（W）。而有关研究表明MIC2蛋白是弓形虫感染的主要毒力因素，因而构建MIC2缺陷株是开发有效活弱毒疫苗的重要方法23。2.7.2微线体蛋白3（MIC3）微线体蛋白3基因无内含子，ORF编码一个富含半胱氨酸的395个氨基酸残基多肽，N端有一较短的疏水信号肽，无跨膜区域氨基酸序列中含5个表皮生长因子样结构域，其中3个串联排列，而另2个则与前3

10、个有重叠，具有一个几丁质连接样结构域，这种序列能跟宿主蛋白一样参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互识别作用。MIC3在弓形虫的各期都能表达，为该病诊断和疫苗研制非常有前景的候选分子24。唐菲等25原核表达了弓形虫RH株MIC3重组蛋白，并检测了该重组蛋白特异免疫反应性，这为利用该蛋白进行弓形虫病诊断与疫苗研究奠定了基础。2.8致密颗粒蛋白2.8.1致密颗粒蛋白1（GRA1）致密颗粒蛋白1分子质量为23kDa，含有2个钙结合域，通过调节钙离子浓度来稳定纳虫泡膜。刘慧颖等26通过构建致密颗粒蛋白GRA1基因真核重组表达质粒，在Hela细胞中表达GRA1蛋白。经检测，GRA1蛋白具有良好的反应原性

11、。构建的重组真核表达质粒制成的核酸疫苗，在小鼠攻毒试验中表现出良好的免疫保护性，为该类疫苗的研发奠定了基础。2.8.2致密颗粒蛋白2（GRA2）致密颗粒蛋白2含一个长241bp的内含子，长约1.3kb，初级翻译产物为一个185个氨基酸的多肽，含有23个氨基酸长的信号肽，富含丝氨酸和苏氨酸。GRA2依赖3个两性a螺旋，在弓形虫侵入后起着诱导纳虫泡膜表面网络结构形成的作用。研究人员利用重组蛋白和佐剂单磷酰脂质免疫小鼠后，能诱导产生高比例的IgG2a/IgG1特异性抗体，脾细胞体外经分泌-排泄抗原刺激后产生大量的IFN-和IL-2。攻毒试验结果表明该重组蛋白能有效抵抗弓形虫慢性感染27。2.8.3致

12、密颗粒蛋白3（GRA3）致密颗粒蛋白3分子质量为30kDa，存在于内管网和纳虫泡膜。为单拷贝基因，其cDNA序列N端有2个起始密码子，开放阅读框含有一个22个氨基酸的疏水区和一个信号肽。沈继龙等28研究表明，GRA3无有效的3D结构，抗原表位少，不宜作为弓形虫有效疫苗候选分子。3展望弓形虫基因工程疫苗的研制方向：对弓形虫与宿主之间的关系作深入研究，特别是针对弓形虫各期所共有的保护性抗原及保护性表位的鉴定，继续深入研究P30基因核酸疫苗、P22蛋白重组疫苗、P43蛋白重组疫苗、P23蛋白多肽疫苗、微线体蛋白2基因缺失苗等，在实用性、安全性及有效性方面显示出强大的潜力。寻找更佳的免疫佐剂、优化免疫程序，提高基因工程疫苗的实用效果。