Tan第五章目的基因的导入和重组子的筛选9041.pptx

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1、本课程内容本课程内容第一章第一章 绪论绪论第二章第二章 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶第三章第三章 基因工程的载体基因工程的载体第四章第四章 目的基因的制备目的基因的制备第五章第五章 目的基因导入和重组子的筛选目的基因导入和重组子的筛选第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达第七章第七章 基因操作的基本技术基因操作的基本技术第八章第八章 植物基因工程及应用植物基因工程及应用第九章第九章 动物基因工程及应用动物基因工程及应用第十章第十章 医学基因工程及应用医学基因工程及应用3/28/20231欢迎同学们听课！第五章第五章 目的基因导入和重组子的筛选目的基因导入和重组子的筛选5.1 DNA片段

2、的连接重组片段的连接重组5.2 受体细胞选择的基本原则受体细胞选择的基本原则5.3 基因转移基因转移5.4 重组子的筛选重组子的筛选3/28/20232欢迎同学们听课！5.1 DNA片段的连接重组片段的连接重组5.1.1 DNA连接类型连接类型5.1.2 DNA片段之间连接的方式片段之间连接的方式5.1.3 DNA重组中需注意的问题重组中需注意的问题3/28/20233欢迎同学们听课！DNA分子连接分子连接 不同的不同的DNA片段（目的基因和载体）经适片段（目的基因和载体）经适当酶切后，在当酶切后，在连接酶连接酶的作用下，连接在一起构的作用下，连接在一起构建成重组建成重组DNA分子分子。3/2

3、8/20234欢迎同学们听课！5.1.1 DNA重组（连接）的类型重组（连接）的类型插入重组插入重组:载体上只有唯一的酶识别位点载体上只有唯一的酶识别位点 随机（非定向）插入随机（非定向）插入置换重组置换重组 (1)载体上有两个同样的酶识别位点载体上有两个同样的酶识别位点 随机（非定向）置换随机（非定向）置换 (2)载体上有两个不同的酶识别位点载体上有两个不同的酶识别位点 定向置换定向置换3/28/20235欢迎同学们听课！5.1.2 DNA片段之间连接的方式片段之间连接的方式具互补黏性末端片段之间的连接具互补黏性末端片段之间的连接具平末端具平末端DNA片段之间的连接片段之间的连接DNA片段末

4、端修饰后进行的连接片段末端修饰后进行的连接DNA片段加片段加linker or adaptor后的连接后的连接3/28/20236欢迎同学们听课！5.1.3 DNA重组中需注意的问题重组中需注意的问题两两端端具具相相同同粘粘性性末末端端的的DNA分分子子会会发发生生自自身环化。身环化。对对于于置置换换重重组组，需需将将切切割割的的DNA分分子子经经过过凝胶电泳分离，回收目的片段。凝胶电泳分离，回收目的片段。无无论论单单酶酶切切还还是是双双酶酶切切，目目的的DNA分分子子均均可可能能发发生生串串联联，必必需需检检测测重重组组DNA插插入入片片段的分子大小。段的分子大小。3/28/20237欢迎同

5、学们听课！5.2 受体细胞及其选择的基本原则受体细胞及其选择的基本原则5.2.1 受体细胞受体细胞5.2.2 受体细胞选择的基本原则受体细胞选择的基本原则3/28/20238欢迎同学们听课！5.2.1 受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞（receptor cell）：）：又称为宿又称为宿主细胞或寄主细胞（主细胞或寄主细胞（host cell）从实验技术上讲从实验技术上讲：是能摄取外源：是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。并使其稳定维持的细胞。从实验目的上讲从实验目的上讲：是有应用价值和理论：是有应用价值和理论研究价值的细胞。研究价值的细胞。3/28/20239欢迎同学们听课！5.2.2 受体

6、细胞选择的原则受体细胞选择的原则外源外源DNA分子能稳定存在，限制酶缺陷型；分子能稳定存在，限制酶缺陷型；重组基因缺陷型；重组基因缺陷型；易于转化易于转化/转导；转导；易筛选易筛选遗传稳定性高，易于扩大培养；遗传稳定性高，易于扩大培养；安全性高；安全性高；内源蛋白酶基因缺失或缺陷；内源蛋白酶基因缺失或缺陷；遗传密码无明显偏好性；遗传密码无明显偏好性；具有较好的转译加工机制；具有较好的转译加工机制；较高的理论和实践应用价值。较高的理论和实践应用价值。3/28/202310欢迎同学们听课！5.3 基因转移（基因转移（gene transfer）载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分载体与目的基

7、因连接后，体系中可能存在下列分子：子：a.a.未连接的载体分子未连接的载体分子b.b.未连接的未连接的DNADNA片段片段c.c.载体的自连载体的自连d.d.含有错误插入片段的重组含有错误插入片段的重组DNADNA分子分子e.e.重组重组DNADNA分子分子转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNADNA片片段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入3/2

8、8/202311欢迎同学们听课！宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将重组克隆鉴定出来。重组克隆鉴定出来。把重组把重组DNA导入受体细胞进行扩增导入受体细胞进行扩增根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞及选择适宜的重组及选择适宜的重组DNA导入的方式：转化、导入的方式：转化、转染和转导。转染和转导。3/28/202312欢迎同学们听课！5.3 基因转移（基因转移（gene transfer）5.3.1 重组质粒重组质粒DNA分子转化大肠杆菌分子转化大肠杆菌5.3.2 重组重组 噬菌体噬菌体DNA分子转导大肠杆菌分子转导大肠杆菌

9、5.3.3 重组重组DNA分子转入真核细胞分子转入真核细胞3/28/202313欢迎同学们听课！5.3.1 重组质粒重组质粒DNA分子转化大肠杆菌分子转化大肠杆菌5.3.1.1 细菌转化的机制细菌转化的机制5.3.1.2 化学转化法化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）诱导大肠杆菌转化法）5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法）电激法（电穿孔转化法）5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素转化率的计算及其影响因素3/28/202314欢迎同学们听课！5.3.1.1 细菌转化的机制细菌转化的机制转化转化(transformation)：重重组组质质粒粒DNA分分子子通通过过与与膜膜蛋蛋白白结结

10、合合进进入入受受体体细细胞胞，并并在在受受体体细细胞胞内内稳稳定定维维持持和和表表达达的的过过程程称称为为转转化化。自自然然界界中中，转转化化并并不不是是细细菌菌或或的的遗遗传传信信息息的的主主要要方方式式，实实验验室室中中只只有有小小部部分分的的细细菌菌可可以以很很容容易易的的转转化化，进进一一步步的的研研究究发发现现，这这类类细细菌菌含含有有DNADNA结结合合和和吸吸收收的的代代谢谢机机制制。正正常常条条件件下下，大大部部分分细细菌菌包包括括大大肠肠杆杆菌菌，只只能能吸吸收收有有限限的的DNADNA，为为了了提提高高转转化化效效率率，建立了一系列的转化方法：建立了一系列的转化方法：a.a

11、.热激法转化感受态细胞热激法转化感受态细胞 b.PEGb.PEG介导的原生质体转化介导的原生质体转化 3/28/202315欢迎同学们听课！c.c.高压电穿孔法转化高压电穿孔法转化 d.d.显微注射法转化显微注射法转化 e.e.接合转化接合转化 f.f.噬菌体转染噬菌体转染3/28/202316欢迎同学们听课！表表41 41 大肠杆菌常用转化方法的比较大肠杆菌常用转化方法的比较转转 化化 方方 法法转转 化化 效效 率率Ca Ca 诱诱 导导10107-87-8原生质体转化原生质体转化10105-65-6噬菌体转化噬菌体转化10107-87-8电电 穿穿 孔孔 法法10106-96-9（100

12、Kb100Kb）结结 合合 转转 化化10104-54-53/28/202317欢迎同学们听课！5.3.1.2 化学转化法（化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化诱导大肠杆菌转化法）法）原原理理：0C、低低浓浓度度（50100 mM）CaCl2，Ca2+改改变变细细胞胞膜膜的的磷磷脂脂层层结结构构，提提高高膜膜的的通通透透性性，而而且且增增强强进入细胞的进入细胞的DNA分子抗分子抗DNase的能力。的能力。特特点点：操操作作简简便便，不不需需特特殊殊仪仪器器，一一般般实实验验室室均均可可进进行行。转转化化率率在在5 1062 107个个转转化化子子/g质质粒粒DNA范范围内，完全可满足常规克隆

13、的需要。围内，完全可满足常规克隆的需要。3/28/202318欢迎同学们听课！5.3.1.2 化学转化法（化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）诱导大肠杆菌转化法）感受态细胞制备：感受态细胞制备：感受态细胞感受态细胞：指处于能吸收周围环境：指处于能吸收周围环境中中DNA分子的生理状态的细胞。分子的生理状态的细胞。菌种活化、培养、收菌和进行菌种活化、培养、收菌和进行CaCl2处理。处理。DNA分子转化感受态细胞：分子转化感受态细胞：冰浴、冰浴、42C热激、热激、37 C恢复、涂板培恢复、涂板培养。养。3/28/202319欢迎同学们听课！5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法）电激法（电穿孔转

14、化法）原理原理：利用高压电脉冲作用，在细菌细胞膜上进行电穿孔利用高压电脉冲作用，在细菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形形成成可可逆逆的的瞬瞬间间通通道道，促促进进外外源源DNA的有效吸收。的有效吸收。特点特点：1.感受态细胞制备简单；感受态细胞制备简单；2.转化率高达转化率高达1091010个转化子个转化子/g质粒质粒DNA；3.用途广泛，但需特殊仪器电激仪。用途广泛，但需特殊仪器电激仪。除除感感受受态态细细胞胞制制备备及及转转化化与与化化学学法法不不同同之之外外，其其余余步步骤骤包包括所设转化对照与化学法相均相同。括所设转化对照与化学法相均相同。3/28/202320

15、欢迎同学们听课！5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素转化率的计算及其影响因素转化率：转化率：是指是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。分子转化受体菌获得转化子的效率。转化率计算：转化率计算：转化子总数转化子总数/DNA分子总数或质量分子总数或质量 或或 转化子总数转化子总数/受体细胞数受体细胞数实际中按转化子总数实际中按转化子总数/DNA分子质量分子质量(g)计算计算3/28/202321欢迎同学们听课！影响转化效率的因素影响转化效率的因素受体细胞的感受态，它决定转化因子能否被吸收进入受体细胞；受体细胞的限制酶系统和其他核酸酶，它们决定转化因子在整合前是否被分解；受体和供体染色体的同源

16、性，它决定转化因子的整合；重组DNA 分子大小重组DNA纯度、浓度3/28/202322欢迎同学们听课！5.3.2 重组重组 噬菌体噬菌体DNA分子转导大肠杆菌分子转导大肠杆菌转染转染(transfection)：采采用用与与质质粒粒DNA转转化化受受体体细细胞胞相相似似的的方方法法，将将重重组组 噬噬菌菌体体DNA分分子子直直接接导导入入受受体体细细胞胞中中的的过过程程，称为转染。称为转染。效效率率较较低低，103104个个噬噬菌菌斑斑/g DNA，较较难难满足一般实验要求，实践中少用。满足一般实验要求，实践中少用。转导转导(transduction)：是是指指通通过过 噬噬菌菌体体（病病毒

17、毒）颗颗粒粒感感染染宿宿主主细细胞胞的途径把外源的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。分子转移到受体细胞内的过程。效效率率高高，可可达达103104个个噬噬菌菌斑斑/g DNA，需需进行体外包装。进行体外包装。3/28/202323欢迎同学们听课！体外装配（体外装配（in vitro packaging）：DNA的转染的转染效率不高，如果将重组的效率不高，如果将重组的分子装配成头分子装配成头-尾结尾结构的病毒粒子，将极大的提高效率。构的病毒粒子，将极大的提高效率。3/28/202324欢迎同学们听课！噬菌体转化大肠杆菌的方法3/28/202325欢迎同学们听课！噬菌体转化大肠杆菌的方法

18、3/28/202326欢迎同学们听课！噬菌体的体外装配有两种不同的系统可以应用：一种是cos位点突变的噬菌体的单品系系统。另一种系统需要两种不同的缺陷品系一个是基因D的突变体，另一个品系是基因E的突变体，由于蛋白质合成的缺陷。体外的装配过程可以利用两种不同培养物的混合物，含有完整的外壳蛋白，完成装配过程。将装配的噬菌体接入细菌就可以完成正常的侵染过程。3/28/202327欢迎同学们听课！噬菌体体外装配的两种系统3/28/202328欢迎同学们听课！噬菌斑和M13噬菌体都能形成噬菌斑，形成的是真正的噬菌斑(透明)，是由于细胞的裂解引起的；而M13的噬菌斑是浑浊的，因为细胞并未裂解，它引起的是细

19、菌生长的减慢，而使细菌的浓度低于周围细胞。3/28/202329欢迎同学们听课！重组噬菌体的鉴定（一）利用插入失活鉴定M13噬菌体，多种噬菌体载体都含有lacZ基因，可以通过插入失活鉴定重组噬菌体。（二）噬菌体的cI基因的插入失活噬菌体载体在cI基因位点上含有单一的酶切位点，该位点上插入外源基因可以导致该基因的失活，引起表现型的变化。正常的噬菌斑是浑浊的，但重组的噬菌斑是清亮的。（三）利用Spi(sensitive to P2 inhibition)表型选择一般来讲，噬菌体不能侵染已被P2噬菌体侵染的大肠杆菌细胞，因此噬菌体被称为Spi+（对P2前噬菌体抑制敏感），插入新的DNA后，能变成sp

20、i-，可以侵染含有P2噬菌体的细菌，只有重组子是Spi-可以形成噬菌斑，因此可以很方便的选择出来。3/28/202330欢迎同学们听课！（四）根据基因组的大小筛选装配系统，只有37kb-52kb的DNA分子可以进入头部结构，小于37kb的不能装配。许多构建的载体切除了部分DNA，因而小于37kb，只有插入外源DNA分子后才能被装配到头部结构中，使载体的长度等于或大于37kb。对于这样的噬菌体载体，只有重组的噬菌体才能进行正常的复制。3/28/202331欢迎同学们听课！利用lacZ基因的插入失活筛选重组噬菌斑 3/28/202332欢迎同学们听课！5.3.3 重组重组DNA分子转入真核细胞分子

21、转入真核细胞重组重组DNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞植物基因工程植物基因工程(见后面第八章见后面第八章)重组重组DNA分子导入哺乳动物细胞分子导入哺乳动物细胞动物基因动物基因工程工程(见后面第九章见后面第九章)3/28/202333欢迎同学们听课！5.4 重组子筛选的方法重组子筛选的方法5.4.1 遗传表型直接检测法遗传表型直接检测法5.4.2 依赖重组子结构特征分析的筛选法依赖重组子结构特征分析的筛选法5.4.3 基因表达产物分析法基因表达产物分析法5.4.4 DNA序列测定法序列测定法3/28/202334欢迎同学们听课！5.4.1 遗传表型直接检测法遗传表型直接检测法根据载体的选择

22、标记的初步筛选根据载体的选择标记的初步筛选根据插入序列的表型特征筛选重组子根据插入序列的表型特征筛选重组子3/28/202335欢迎同学们听课！通过插入失活可以初步筛选重组子，但筛选到的克隆是否插入了正确的片段，还需要进一步的鉴定，鉴定的方法主要有如下几种情况：1 限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。2 PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定3 菌落原位杂交法：将在后面的章节中提到。4 基因产物检测法：如果使用的是表达载体，那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆

23、。3/28/202336欢迎同学们听课！抗药性选择标记插入失活抗药性选择标记插入失活/插入表达筛选插入表达筛选法法pBR322有许多单一切点的限制性位点，可以用来切开分子插入新的DNA片段。如BamH I可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。这属于负向选择3/28/202337欢迎同学们听课！根据载体的选择标记的初步筛选根据载体的选择标记的初步筛选抗药性选择标记插入失活抗药性选择标记插入

24、失活/插入表达筛选法插入表达筛选法-半乳糖苷酶显色反应筛选法（半乳糖苷酶显色反应筛选法（互补筛互补筛选）选）利用报告基因筛选植物转化细胞利用报告基因筛选植物转化细胞利用遗传选择标记筛选哺乳底物转基因细胞利用遗传选择标记筛选哺乳底物转基因细胞3/28/202338欢迎同学们听课！3/28/202339欢迎同学们听课！利用tetR的插入失活筛选重组克隆3/28/202340欢迎同学们听课！抗药性选择标记插入表达筛选法抗药性选择标记插入表达筛选法正向选择正向选择重组子在培养基上能生长，而非重组子不能生长。重组子在培养基上能生长，而非重组子不能生长。3/28/202341欢迎同学们听课！-半乳糖苷酶显

25、色反应筛选法（半乳糖苷酶显色反应筛选法（互补筛选）互补筛选）载体：含有载体：含有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和头的调控序列和头146个个aa的编码序列的编码序列宿主：缺失了宿主：缺失了lacZ基因，可编码基因，可编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端端序列序列-互补：互补：lacZ基因上基因上缺失近操纵基因区段缺失近操纵基因区段的突变体可以的突变体可以与与带有完整的近操纵基因区段带有完整的近操纵基因区段的的-半乳糖苷酶隐性突变半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。体之间实现互补。在这样的系统中，转化质粒的细菌获得了在这样的系统中，转化质粒的细菌获得了amp抗性，抗性，自连质粒可以合成正

26、常的酶，而重组质粒的细菌不能合自连质粒可以合成正常的酶，而重组质粒的细菌不能合成正常的酶。在培养基中添加酶的诱导物成正常的酶。在培养基中添加酶的诱导物IPTG，乳糖，乳糖的类似物的类似物X-gal乳糖酶作用下显示蓝色，蓝斑是载体自乳糖酶作用下显示蓝色，蓝斑是载体自连产物，而白色克隆是重组质粒。这一系统称为连产物，而白色克隆是重组质粒。这一系统称为lac selection。3/28/202342欢迎同学们听课！X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)

27、水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。3/28/202343欢迎同学们听课！利用lacZ基因的插入失活筛选重组子3/28/202344欢迎同学们听课！植物转基因载体的选择标记植物转基因载体的选择标记/报告基因报告基因新霉素磷酸转移酶新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferaser-II,NPTII)基因基因:抗新霉素（抗新霉素（neomycin）或卡那霉素）或卡那霉素（kanamycin）潮霉素磷酸转移酶潮霉素磷酸转移酶(hygromycin pho

28、sphotransferase,HPT)基因基因:抗卡那霉素或潮霉素（抗卡那霉素或潮霉素（hygromycin）氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶(chloraphenicol acetyltransferase,CAT)基因基因:抗氯霉素抗氯霉素-葡萄糖酸苷酶葡萄糖酸苷酶(-Glucuronidase,GUS)基因基因:荧光检测或组织化学检测，非正向选择荧光检测或组织化学检测，非正向选择抗除草剂抗除草剂bar基因：基因：抗抗PPT（L-谷氨酸的类似物）谷氨酸的类似物）3/28/202345欢迎同学们听课！动物转基因载体的选择标记基因动物转基因载体的选择标记基因氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶(

29、chloraphenicol acetyltransferase,CAT)基因基因:抗氯霉素抗氯霉素新霉素磷酸转移酶新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferaser-II,NPTII)基因基因:抗新霉素（抗新霉素（neomycin）或卡那霉素）或卡那霉素（kanamycin）胸苷激酶基因（胸苷激酶基因（thymidine kinase,TK）二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)基基因因黃嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶黃嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)3/28/202346欢迎同学们听课！5.4.2 依赖重组子结构

30、特征分析的筛选法依赖重组子结构特征分析的筛选法5.4.2.1 菌落裂解琼脂糖凝胶电泳快速检测法菌落裂解琼脂糖凝胶电泳快速检测法5.4.2.2 限制性内切酶酶切分析检测限制性内切酶酶切分析检测5.4.2.3 PCR法检测法检测5.4.2.4 核酸分子杂交检测法核酸分子杂交检测法3/28/202347欢迎同学们听课！5.4.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测原理原理：根据外源根据外源DNA片段插入的重组质粒与载体片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子。之间大小的差异来区分重组子和非重组子。特点特点：操作简单、快捷，成本低，适合大规模筛选。操作简单、快捷，成本低

31、，适合大规模筛选。特别适用于插入片段较大的重组子的筛选。特别适用于插入片段较大的重组子的筛选。3/28/202348欢迎同学们听课！5.4.2.2 限制性内切酶酶切分析检测限制性内切酶酶切分析检测原理原理：小小量量抽抽提提质质粒粒DNA，利利用用限限制制性性内内切切酶酶酶酶切切，通通过过电电泳泳分分析析确确定定是是否否含含有有插插入入片片段段及及其其大大小小、插入方向。插入方向。特点特点：可可以以区区别别假假阳阳性性重重组组子子，结结果果判判断断较较准准确确，但操作比较复杂，不适用于大规模的筛选。但操作比较复杂，不适用于大规模的筛选。3/28/202349欢迎同学们听课！5.4.2.3 PCR

32、法检测法检测原理原理：利用载体上已知序列设计的引物进利用载体上已知序列设计的引物进行行PCR反应，通过电泳分析确定是否含有反应，通过电泳分析确定是否含有插入片段及其大小。插入片段及其大小。特点特点：操作简单，便于大规模筛选，但操作简单，便于大规模筛选，但Taq酶成本要考虑。酶成本要考虑。3/28/202350欢迎同学们听课！5.4.2.4 核酸分子杂交检测法核酸分子杂交检测法菌落菌落/噬菌斑原位杂交：噬菌斑原位杂交：直直接接把把菌菌落落或或噬噬菌菌斑斑印印迹迹转转移移到到杂杂交交膜膜上上，不不必必进进行行核核酸酸分分离离纯纯化化、限限制制酶酶酶酶切切及及凝凝胶胶电电泳泳分分离离等等操操作作，而

33、而是是经经溶溶菌菌和和变变性性处处理理后后使使DNA暴暴露露出出来来并并与与杂杂交交膜膜结结合合，再再与与特特异异性性标标记记探探针针杂杂交交，筛筛选选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。出含有插入序列的菌落或噬菌斑。培培养养基基上上的的菌菌落落/噬噬菌菌斑斑按按原原来来的的位位置置不不变变地地转转移移到到杂杂交交膜膜上上，并并在在原原位位上上发发生生溶溶菌菌、DNA变变性性和杂交作用。和杂交作用。3/28/202351欢迎同学们听课！菌落菌落/噬菌斑原位杂交特点噬菌斑原位杂交特点需标记探针，操作复杂。需标记探针，操作复杂。适合大规模文库筛选，不适于小量的筛选。适合大规模文库筛选，不适于小量的筛选。

34、3/28/202352欢迎同学们听课！5.4.3 基因表达产物分析法基因表达产物分析法免疫化学检测法：与菌落免疫化学检测法：与菌落/噬菌斑原位杂交类似，噬菌斑原位杂交类似，不同的是使用抗体探针。不同的是使用抗体探针。DNA-蛋白质筛选法：与菌落蛋白质筛选法：与菌落/噬菌斑原位杂交噬菌斑原位杂交类似，但使用类似，但使用DNA作探针，检测外源基因编码作探针，检测外源基因编码的的DNA结合蛋白。结合蛋白。专一性强、灵敏度高。专一性强、灵敏度高。前提条件：克隆基因可在宿主细胞内表达，并前提条件：克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。且有目的蛋白的抗体。3/28/202353欢迎同学们听课！

35、5.4.4 DNA序列测定法序列测定法对克隆对克隆DNA片段进行序列测定及分析，片段进行序列测定及分析，鉴定出重组鉴定出重组DNA分子中是否含有目的基分子中是否含有目的基因。因。可以获得目的基因的编码序列和基因调控可以获得目的基因的编码序列和基因调控序列。序列。3/28/202354欢迎同学们听课！复习思考题复习思考题1.名词解释：名词解释：2.受体细胞；感受态细胞；转化；转导；转受体细胞；感受态细胞；转化；转导；转染；转换子；重组子；转化率；负筛选；正筛染；转换子；重组子；转化率；负筛选；正筛选；选；互补筛选互补筛选3.2.试述几种常用的转化方法。试述几种常用的转化方法。4.3.试述试述根据载体的选择标记进行重组子筛选根据载体的选择标记进行重组子筛选的方法和原理。的方法和原理。4.试述根据插入序列的表型特征进行重组子筛选试述根据插入序列的表型特征进行重组子筛选的方法和原理。的方法和原理。3/28/202355欢迎同学们听课！演讲完毕，谢谢观看！