PCR技术的原理及应用ppt课件.ppt
《PCR技术的原理及应用ppt课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《PCR技术的原理及应用ppt课件.ppt(83页珍藏版)》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR技术的原理及应用技术的原理及应用经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加
2、赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGA
3、CGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年,Khorana提出:经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难,以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能,所以,Kh
4、orana的设想被人们遗忘了经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年,美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(PCR)基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行,随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年,Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖经营者提供商
5、品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用Kary B.Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用生物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学
6、学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA获取特定获取特定获取特定获取特定DNADNADNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D D D DN N N NA A A A片片片片段段段段经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物引物引物引物引物M13M13噬
7、菌体噬菌体Sanger的测序技术引物引物DNADNA聚合酶聚合酶经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNADNADNA片段片段片段片段经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用94949494变性变性变性变性50-6550-65退火退火退火退火XX延伸延伸延伸延伸经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者
8、的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用9494949455553737经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用7272949494945555PCRPCR循环
9、循环循环循环经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用1234522557294时间(min)温度()PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程P
10、CR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间(min)温度()适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应
11、当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束9
12、5第2轮开始经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PC
13、R的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR在医学和科研中的应用在医学和科研中的应用提提 纲纲经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧
14、光基团,利用荧光,利用荧光信号累积信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程,最后通过标进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用常常 规规 PCR PCR技术:技术:对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析。进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。测。实时荧光定量实时荧光定量
15、PCR PCR 原理原理经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时定量实时定量PCR技术:技术:利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化,通过,通过Ct值值和标准曲和标准曲线的分析对线的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析。定量分析。经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用如何对起始模板定量?如何对起始模板定量?通过通过Ct
16、值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析三个概念:三个概念:扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理-扩增曲线扩增曲线扩增曲线图:扩增曲线图:横坐标:横坐标:扩增循环数(扩增循环数(CycleCycle)
17、;);纵坐标:纵坐标:荧光强度荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光荧光阈阈值值荧光信号荧光信号阈阈值值 (threshold threshold):q 前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline),即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准差的10倍q 手动 设置:原则要大于样本的荧光
18、背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义:PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量PCR PC
19、R 原理原理 -Ct值的重现性横轴:横轴:PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴:荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点值的特点:相同模板进行96次扩增,终点处产物量不恒定;Ct值则极具重现性经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -定量原理定量原理理想的PCR反应:X=X0*2n非理想的PCR反应:X=X0(1+Ex)n n:扩增反应的循环次数 X:第n次循环后的产物量 X0:初始模板量 Ex:扩增效率经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增
20、加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:lg M=lg X0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:lg X0=-Ct lg(1+Ex)+lg M (3)Lg Lg浓度与循环数呈线性关系,根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系,根据样品扩增达到域值域值的循环数即的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。就可
21、计算出样品中所含的模板量。经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多,荧光达到域值的循环数越少,即Ct值越小。q Log浓度与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量。经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq
22、通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 绝对定量绝对定量25经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍
23、的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用非特异性荧光标记:非特异性荧光标记:1、SYBR Green 特异性荧光标记:特异性荧光标记:2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -DNA -DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记QQR经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品
24、的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1 1 SYBR Green 法经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用SYBR Green 法q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时,DNA双链分开,无荧光q 复性和延伸时,形成双链DNA,SYBR Green 发荧光,在此阶段采集荧光信号(一般设置在复性阶段)。SYBR Green 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受
25、到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理 SYBR Green I
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- PCR 技术 原理 应用 ppt 课件
限制150内